鞣花酸对HEK-293细胞的DNA损伤毒性作用以及可能的氧化应激、溶酶体膜通透机制研究

摘要

目的:
　　 鞣花酸(Ellagicacid，EA)，是广泛存在于各种具有软果或坚果的植物组织中的一种天然多酚成分。多项研究结果表明，EA具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、抗菌和抗病毒等生物学作用，同时已有研究报道EA具有DNA损伤活性。本研究通过观察EA致HEK-293细胞DNA损伤，探讨EA对DNA损伤可能的毒性机制（氧化应激和溶酶体膜通透），为评估EA对人类的健康影响提供试验及理论依据。
　　 方法:
　　 以HEK-293细胞作为试验系统。通过单细胞凝胶电泳试验检测EA引起体外HEK-293细胞的DNA损伤，评价EA的DNA损伤毒性。为探讨其可能的DNA损伤机制，以2'，7'—二氢二氯荧光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分别测定细胞内活性氧(ROS)以及还原性谷胱甘肽(GSH)水平，以免疫组化方法检测细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达水平，以吖啶橙(AO)和罗丹明123(Rhodamine123)分别测定细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平，通过N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预试验观察氧化性损伤对DNA损伤的影响，通过氯化铵(NH4Cl)干预试验观察溶酶体膜稳定性对DNA损伤的影响，通过地昔帕明（desipramine，酸性神经鞘磷脂酶的抑制剂）和抑胃肽（pepstainA，组织蛋白酶D的抑制剂）干预试验观察溶酶体内酸性水解酶对DNA损伤的影响。试验结果用SPSSvl1.5统计软件进行统计分析。
　　 结果:
　　 EA(120μM)作用于HEK-293细胞1小时后，引起DNA链断裂，细胞成彗星样拖尾，与DMSO空白对照组比其尾长明显增长，尾DNA％增大;同时，EA（60μM-120μM）作用于HEK-293细胞3h后，可致细胞内8-OHdG的表达水平升高;EA(120μM)作用于HEK-293细胞1小时后，细胞内ROS生成增加、GSH水平下降;EA（30μM-120μM）作用于HEK-293细胞1小时后，细胞内溶酶体膜稳定性下降，线粒体膜电位水平变化不明显。用NH4Cl、NAC、地昔帕明和抑胃肽四种干预剂预处理后，EA引起的DNA链断裂、细胞内ROS以及溶酶体膜通透都有明显地减弱，说明上述四种干预剂的保护作用十分显著。
　　 结论:
　　 高浓度EA能够引起细胞DNA损伤，对HEK-293细胞具有DNA损伤毒性。EA可引起HEK-293细胞内ROS生成增加，细胞内抗氧化物质GSH减少，使细胞处于氧化应激状态，并使HEK-293细胞内氧化性DNA损伤标志性产物8-OHdG表达增强。抗氧化剂NAC在降低了细胞内ROS水平的同时，减弱EA引起的DNA链断裂程度，表明EA对HEK-293细胞的DNA损伤毒性与DNA氧化性损伤有关。EA引起HEK-293细胞内溶酶体膜稳定性下降，NH4Cl对EA引起的溶酶体膜稳定性及EA引起的DNA损伤具有保护作用，抑胃肽和地昔帕明减弱了EA引起的DNA链断裂，这说明EA引起的HEK-293细胞DNA损伤的机制与溶酶体有关，并且溶酶体内酸性水解酶可能在DNA损伤毒性方面发挥重要作用。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．主要药品与试剂

2．主要仪器

3．试验方法

4．统计方法

结果

1．EA诱发HEK-293细胞DNA链断裂

2．EA对细胞内8-OHdG表达水平的影响

3．EA对HEK-293细胞内GSH水平的影响

4．EA对HEK-293细胞内ROS水平的影响

5．NAC对EA引起的HEK-293细胞损伤的保护作用

6．EA对HEK-293细胞溶酶体膜稳定性的影响

7．EA对HEK-293细胞线粒体膜电位水平的影响

8．NH4Cl对EA引起的HEK-293细胞损伤的保护作用

9．抑胃肽(pepstain A)和地昔帕明(desipramine)对EA引起的HEK-293细胞DNA损伤起保护作用

讨论

1．EA引起HEK-293细胞的DNA损伤

2．EA引起HEK-293细胞产生氧化应激及其与DNA损伤作用的关系

3．EA对HEK-293细胞溶酶体膜稳定性的影响

结论

参考文献

综述

致谢