胚胎PAPPA,poFUT1的表达调控与胚胎着床相关性的研究

摘要

目的与意义：人胚胎的发育成熟及着床是一个复杂的过程。其过程包括:受精卵形成，并沿着输卵管向子宫腔内移动，同时伴随卵裂。经历2-细胞期，4-细胞期，8-细胞期后，逐渐发育形成含有多个细胞的桑椹胚，最终发育为成熟的胚泡。成熟的胚泡进入子宫腔内之后，与子宫内膜相互作用，开始胚胎着床过程。胚胎着床的过程主要包括三个步骤，即胚泡的定植，胚泡与子宫内膜的黏附及胚泡侵入子宫内膜的过程。胚胎的发育成熟及着床是建立和维持妊娠的关键步骤。这一过程中，胚胎和内膜阶段特异地表达的分子，参与调控胚胎发育成熟及着床过程。
　　妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma proteinA，PAPPA)是由胎盘所分泌的一种蛋白质。PAPPA在妊娠的第五周孕妇的血清中可以检测到，随着妊娠过程的进行，血清中的PAPPA含量持续升高，至妊娠末期达到峰值。研究发现，在早孕期，PAPPA的水平与许多疾病，如先兆流产等的发生密切相关，这提示我们PAPPA可能在妊娠早期有重要的作用，但是目前还没有关于PAPPA与胚胎的发育成熟和着床的相关性的报道。
　　糖基转移酶及其产物与胚胎发育，炎症反应，肿瘤发生发展等过程密切相关。岩藻糖基转移酶是糖基转移酶家族的重要成员。根据催化合成糖基化位点的不同，岩藻糖基转移酶家族(Fucosyltransferases，FUTs)主要有两大类:一类是催化合成N-岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶，如FUT4、FUT7等;另一类是催化合成O-岩藻糖苷键的岩藻糖基转移酶（protein O-fucosyltransferases，poFUTs），如poFUT1和poFUT2。研究发现，FUT4和FUT7在胚胎着床过程中有重要作用，关于poFUT1和poFUT2在胚胎着床过程中的作用及机制尚无报道。
　　激素和细胞因子在胚胎发育成熟及着床过程中发挥重要作用。其中，孕酮和白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)的作用尤为重要。研究发现，孕酮在卵裂期能促进胚胎细胞的增殖而促进胚胎的发育成熟。此外，LIF通过增加胚胎的滋养层细胞的侵袭能力而促进胚胎着床。孕酮和LIF均可以与其受体结合，参与调节与胚胎发育成熟和着床相关的多种因子的表达。
　　本文通过对PAPPA和poFUT1的表达调控的研究，探讨PAPPA和poFUT1及其上游分子孕酮和LIF在胚胎发育成熟和着床过程中的作用，为临床判断胚胎的质量及诊断先兆流产提供新的思路和理论依据。
　　实验方法：
　　（一）妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.ELISA分析孕妇血清中PAPPA水平与孕酮的表达水平;
　　2.RT-PCR检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;
　　3.WB检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;
　　4.免疫组化和免疫荧光检测人绒毛及蜕膜组织中PAPPA的表达水平;
　　5.Real-time PCR及ELISA检测人滋养层细胞(JAR)中PAPPA的表达水平;
　　6.利用脂质体转染瞬时转染PAPPA siRNA至JAR细胞中，下调PAPPA的表达;
　　7.CCK-8及细胞计数分析细胞的增殖能力;
　　8.采用体外胚胎黏附模型检测JAR细胞的黏附能力。
　　（二）O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.免疫组化检测正常早孕及先兆流产妇女的绒毛组织中poFUT1和poFUT2的表达水平;
　　2.ELISA检测正常早孕及先兆流产妇女的血清中LIF的表达水平;
　　3.免疫荧光检测JAR细胞中poFUT1的表达水平;
　　4.Real-time PCR检测JAR细胞的poFUT1的表达水平;
　　5.WB检测JAR细胞的poFUT1的表达水平;
　　6.Transwell法分析JAR细胞的迁移和侵袭能力;
　　7.利用脂质体转染的方法瞬时转染poFUT1 siRNA至JAR细胞中，下调poFUT1的表达;
　　8.明胶酶谱实验分析JAR细胞中MMP-2的活性;
　　9.WB检测JAR细胞中TIMP-1/-2，STAT和PI3K/Akt信号通路的相关分子的表达。
　　结果：
　　（一）妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.孕妇血清中PAPPA的表达与血清中的孕酮水平相关;
　　2.PAPPA仅在人绒毛组织中的表达;
　　3.孕酮可以促进JAR细胞中的PAPPA的表达;
　　4.下调PAPPA的表达可以抑制JAR细胞的黏附与增殖;
　　5.孕酮通过上调JAR细胞中PAPPA的表达而促进JAR细胞的黏附与增殖。
　　（二）O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.poFUT1和poFUT2在绒毛组织中表达，并且在先兆流产组的poFUT1的表达水平低于正常早孕组;
　　2.先兆流产组血清中LIF的表达水平低于正常早孕组;
　　3.poFUT1在JAR细胞中表达;
　　4.poFUT1的表达与绒毛组织和JAR细胞迁移，侵袭能力相关;
　　5.LIF上调JAR细胞中poFUT1的表达;
　　6.LIF通过上调poFUT1的表达促进体外培养的绒毛组织和JAR细胞的迁移及侵袭能力;
　　7.LIF通过poFUT1介导的PI3K/Akt信号通路促进JAR细胞的迁移以及侵袭能力。
　　结论：
　　（一）妊娠相关血浆蛋白A的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.孕妇血清中PAPPA的表达与孕酮水平呈正相关;
　　2.PAPPA仅在人绒毛组织中表达;
　　3.在JAR细胞中，孕酮可以上调PAPPA的表达;
　　4.在体外黏附模型中，PAPPA可以促进JAR细胞的黏附与增殖。
　　（二）O-岩藻糖基转移酶的表达调控与胚胎着床相关性的研究
　　1.poFUT1和LIF在先兆流产病人的血清中表达下降;
　　2.LIF上调JAR细胞中poFUT1基因的表达;
　　3.poFUT1促进人绒毛组织和人滋养层细胞的迁移及侵袭能力;
　　4.LIF通过上调poFUT1的表达及其介导的PI3K/Akt信号通路促进JAR细胞的迁移以及侵袭。