经动脉灌注地塞米松对大鼠脑缺血-再灌注模型的神经保护作用研究

摘要

脑卒中是人类致残、致死的主要病因之一。在我国，脑卒中是第一位的致死因素，2013年的数据表明:中风造成我国70岁以上人群200万人的死亡，而在49岁以下人群，中风也是导致死亡的主要原因之一。急性缺血性卒中是最多见的卒中类型，约占患者总数的80％。脑缺血后会引发一系列的病理生理及生化反应，如乳酸堆积、自由基释放、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸中毒、炎性过程及凋亡等，称为脑缺血的瀑布级联反应。其中炎性反应在脑缺血损伤的发展过程中的扮演着重要角色。脑缺血诱导炎性因子大量产生，引起急性炎症反应，加重患者脑损害。
　　糖皮质激素类药物具有快速而强大的抗炎作用。既往的动物实验表明，糖皮质激素类药物可以降低脑缺血所致的脑损害，是一种潜在的神经保护剂。早期的临床实验也证实应用糖皮质激素类药物能够降低缺血性卒中患者的死亡率，改善患者神经功能。然而，在此后的多个临床实验中，糖皮质激素类药物未表现出神经保护作用，甚至有实验发现，生理剂量糖皮质激素会加重脑缺血大鼠的神经损害。目前，对于糖皮质激素类药物在缺血性卒中治疗上的价值存在争议。
　　分析既往实验发现:大剂量糖皮质激素类药物对脑缺血多具有显著的治疗作用，而生理剂量则多无效，甚至加重神经损害;治疗有效的实验，给药时间多在脑缺血之前或缺血后立即给药。由此推测:糖皮质激素类药物对脑缺血的治疗作用呈明显的时间-剂量依赖关系，即梗死早期大剂量糖皮质激素类药物治疗能够产生显著的神经保护作用。本研究利用大鼠大脑中动脉闭塞模型，给予大剂量地塞米松，对地塞米松治疗缺血性卒中的时间依赖性及其机制进行了探讨。
　　大剂量地塞米松治疗会造成药物副作用的增加，而严格的治疗时间窗必然会限制药物的临床应用。与传统的经静脉给药相比，经动脉给药治疗，药物直达病变组织，不经肝脏代谢，避免了药物的“首过效应”，不但可以获得更高的局部药物浓度，并且由于药物作用集中在给药部位，减少了药物的全身毒、副作用。再者，由于药物直达病变部位，避免了药物经血液循环到达病变部位的时间延迟，经动脉给药缩短了药物在局部达到治疗浓度所需的时间，为缺血性卒中的治疗争取了宝贵的“时间窗”。经动脉药物灌注可以很好地解决地塞米松的治疗剂量大和治疗时间窗狭窄的问题。在进一步的研究中，利用改进的经动脉药物灌注方法，探究了经动脉地塞米松灌注对地塞米松治疗时间窗和治疗剂量的影响。
　　第一部分 大鼠大脑中动脉闭塞模型基础上的经动脉药物灌注方法改进
　　目的:改进经动脉药物传输方法，建立适用于经动脉药物灌注研究的大鼠缺血性卒中模型。
　　方法:经动脉药物灌注微管装置的制作:用环氧化物胶包裹的1mm长的尼龙线（外径:0.181 mm）堵塞的PE-0402管（长约50mm）的一端。在距离PE-0402管被堵塞端2mm处的侧壁做1mm长的纵行切口，作为药物的输出口。经颈外动脉插入微管装置，使其头端堵塞到达大脑中动脉开口，在选定的时间点，使用微管装置，经头端纵行切口向动脉传输药物，使用一个微管装置，同时达到闭塞大脑中动脉和经动脉药物传输的目的。为检验微管装置诱导局灶脑缺血的能力，利用广泛使用的线栓（线栓组）和自制的微管装置（微管组）分别建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，建模后24h，比较两组大鼠的神经缺损评分和脑梗死的体积。为检验改进方法的药物传输能力，对比了原有经动脉药物传输方法（PE-10组）与改进方法(microcatheterdevice组)的药物传输效率。大脑中动脉闭塞模型建立后2h，通过不同方法向模型大鼠灌注等量伊文斯蓝溶液。灌注后4h，利用分光光度法检测不同组别大鼠梗死半球的伊文斯蓝渗出量。
　　结果:模型建立后24h，线栓组和微管组大鼠的神经缺损评分相当，两组大鼠脑梗死的体积差别没有统计学意义。伊文斯蓝灌注后4h，microcatheter device组大鼠梗死半球的伊文斯蓝的渗出量为35.9±7.7μ g/g，显著高于PE-10组(17.7±4.4μ g/g)。
　　结论:1.本研究改进了大鼠大脑中动脉闭塞模型基础上的经动脉药物灌注方法，使用同一微管装置同时达到闭塞大鼠大脑中动脉和经动脉药物灌注的目的;2.微管装置诱导大鼠大脑中动脉闭塞的能力与广泛使用的线栓相当，其药物传输效能较已有方法更高;3.使用微管装置的动脉给药方法造模更简单、梗死更稳定，并且可适用于不同研究策略:药物传输可以在缺血-再灌注之前也可以在缺血-再灌注之后，可以用于缺血-再灌注模型的经动脉药物传输研究，也可以用于永久梗死模型的相关研究。
　　第二部分 大剂量地塞米松对大鼠脑缺血-再灌注模型的神经保护作用研究
　　目的:研究大剂量地塞米松对缺血性卒中的治疗效果并探索其治疗时间窗及机制。
　　方法:线栓法建立大鼠脑缺血-再灌注模型，在建模后不同时间点(30min、60min、120min)，经静脉给予10mg/kg地塞米松。在缺血脑组织再灌注后48h，比较不同组别大鼠的神经缺损评分和脑梗死体积，探索大剂量地塞米松治疗缺血性卒中的疗效及时间依赖性。为进一步探究地塞米松治疗缺血性卒中的机制，利用免疫组织化学、Western blot和ELISA等检测手段，比较了不同时间点(30min、60min)给药对NF-kB激活及炎性因子（TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS）表达的影响。
　　结果:30min给药组大鼠的神经缺损评分(1.9±0.7)和梗死体积(20.4±6.1％)，较梗死对照组明显降低。60min组、120min组大鼠的神经缺损评分和梗死体积与梗死对照组相当。免疫组织化学染色的结果显示，大脑中动脉闭塞后30min给予大剂量地塞米松，能够显著降低海马区NF-kB p65的表达。Western blot发现大脑中动脉闭塞后2h，梗死周边区NF-kB p65、p-p65表达量一过性增高，而在大脑中动脉闭塞后30min给予大剂量地塞米松，能够显著抑制梗死周边区的NF-kB p65、p-p65表达增加，减少炎性因子（COX-2、iNOS）产生。ELISA发现，大脑中动脉堵塞后30min给予大剂量地塞米松显著降低了梗死周边区促炎因子（TNF-α、IL-1β）的水平。
　　结论:1.大剂量地塞米松治疗对脑缺血-再灌注大鼠模型有神经保护作用，并且具有严格的治疗时间窗;2.大剂量地塞米松对脑缺血-再灌注大鼠模型的神经保护作用与地塞米松抑制NF-kB激活从而减少炎性因子的产生相关。
　　第三部分 经动脉灌注地塞米松对大鼠脑缺血-再灌注模型的神经保护作用研究
　　目的:探讨经动脉给药对地塞米松的治疗剂量和治疗时间窗的影响。
　　方法:利用微管装置建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，分别在模型建立后30min和60min，按照不同剂量（10mg/kg或者2mg/kg），经不同方式（经静脉或者经动脉）给予地塞米松或安慰剂。脑缺血-再灌注后48h，比较不同组别大鼠的神经缺损评分、运动功能（前肢错误放置测试、平行棒测试、攀绳测试）及梗死体积。
　　结果:大脑中动脉闭塞后60min，经动脉小剂量地塞米(2mg/kg)松灌注能够显著改善脑缺血-再灌注大鼠模型的神经缺损评分，提高其运动能力，减小梗死体积。其治疗效果与大脑中动脉闭塞后30min，经静脉大剂量地塞米(10mg/kg)治疗相当。
　　结论:经动脉地塞米松灌注可以扩展地塞米松治疗缺血性卒中的时间窗，减少总的药物用量。

目录

声明

摘要

第一部分 大鼠大脑中动脉闭塞模型基础上的经动脉药物灌注方法改进

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 大剂量地塞米松对大鼠脑缺血-再灌注模型的神经保护作用研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 经动脉灌注地塞米松对大鼠脑缺血-再灌注模型的神经保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 经动脉给药治疗缺血性卒中的基础研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢