基于脱细胞心脏支架的三维心肌组织化模型体外构建、评价及优化

摘要

目的:冠心病(CHD)是引起心血管疾病(CVD)患者死亡的重要原因之一，心脏移植是终末期心脏病患者的首选治疗方法。心脏组织工程目前发展迅速，其最终目的是体外再造心脏，然而目前尚有许多难题待解决，如支架材料的制备以及种子细胞的选择。近年来具备天然三维结构的脱细胞支架及体外可诱导分化的骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)在心脏组织工程研究领域中应用广泛。本研究旨在优化脱细胞心脏支架的制备方法，体外构建基于脱细胞心脏支架的三维心肌组织化模型，探索脱细胞心脏支架及BMSCs在心脏组织工程中潜在应用价值，以期将其应用于CHD患者的治疗及临床药理的研究。
　　方法:本研究通过联合应用十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-x100)对大鼠心脏行逆行主动脉灌流制备脱细胞心脏支架。采用细胞核染色、HE染色、DNA含量检测以及扫描电镜(SEM)对制备的脱细胞心脏支架进行评价。通过联合应用胰蛋白酶及胶原酶分离原代心肌细胞，采用细胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。通过添加10μM5-氮杂胞苷(5-azacytidine)诱导BMSCs向心肌样细胞定向分化。同时，分别选取新生大鼠心肌细胞及BMSCs作为种子细胞体外构建三维心肌组织化模型。采用倒置显微镜及免疫荧光显微镜动态观察支架上细胞生长状态。结合旋转生物反应器(RCCS)实现动态培养，分别采用活-死细胞染色、HE染色、SEM及实时定量PCR检测对此三维(3D)培养体系进行评价。
　　结果:脱细胞心脏支架大体呈半透明囊状。HE染色及SEM观察示支架呈多孔网状或束状结构，细胞核染色未见细胞核残留。进一步行DNA含量检测示正常心脏组织DNA含量为229.35±0.06ng/mg，而脱细胞心脏支架DNA含量仅为1.64±0.03ng/mg，其含量明显低于正常心脏组织。新生大鼠心肌细胞在分离培养24h后开始出现自发搏动，培养至72h细胞连接成片出现同步搏动。细胞免疫荧光染色示分离纯化的心肌细胞能够表达心肌细胞特异性功能蛋白α-actinin以及troponin I。基于新生大鼠心肌细胞构建的三维培养模型经活-死细胞染色及HE染色观察示三维培养条件下心肌细胞生长状态良好，未见明显死细胞，细胞主要黏附生长于支架表面。基于BMSCs构建的三维培养模型经荧光显微镜动态观察、HE染色及SEM检测示细胞沿支架纤维生长，增殖迅速并逐渐形成类组织块样结构。RCCS动态培养条件下细胞更易生长入支架内部。实时定量PCR检测结果显示经5-氮杂胞苷诱导后BMSCs转录因子Gata4的表达水平显著提高。将BMSCs与脱细胞心脏支架复合，培养2周后其Gata4的表达水平显著高于阴性对照组及经5-氮杂胞苷诱导组BMSCs。
　　结论:本研究运用灌流法成功制备脱细胞彻底且细胞外基质保留较完整的脱细胞心脏支架。此支架不但拥有天然三维结构及良好的生物相容性，而且还具有诱导BMSCs向心肌细胞方向分化的潜能。通过联合应用RCCS，基于脱细胞心脏支架构建的三维心肌组织化模型能够更好地模拟体内微环境，可为临床药物研究提供新的平台，对CVD的治疗具有潜在的应用价值。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验动物及主要试剂、仪器

2． 制备脱细胞心脏支架

3． 细胞核荧光染色

4．DNA含量检测

5． 分离培养原代心肌细胞

6． BMSCs体外培养及诱导分化

7． 细胞免疫荧光染色

8． 构建三维培养模型

9． RCCS动态培养

10．LlVE／DEAD染色

11．H-E染色

12． 扫描电镜观察

13． 实时定量RT-PCR检测

14．统计分析

结果

1．脱细胞心脏支架的大体观察

2．脱细胞心脏支架的特征

3．原代心肌细胞的特征

4． BMSCs的形态特征

5． BMSCs诱导分化

6． 原代心肌细胞在脱细胞心脏支架上的分布及活性

7． BMSCs在脱细胞心脏支架上的分布及活性

8． RCCS动态培养

讨论

结论

参考文献

综述

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