microRNA-501-5p通过靶向CYLD促进子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力

摘要

背景:在世界范围内子宫颈癌是一种常见的女性致死性恶性肿瘤，尽管子宫颈癌近年来的发病率和死亡率明显下降，它依旧在女性常见肿瘤中位居第四位。microRNAs（miRNAs）是一类单链非编码小RNA分子，其长度为18-24个碱基，可与靶mRNA通过碱基互补配对相结合，导致靶mRNA降解或者抑制其翻译。在过去的十几年中，在包括子宫颈癌在内的肿瘤领域，越来越多的研究表明miRNA扮演着一个重要调控者的角色。
　　microRNA-501-5p（miR-501）是一种非保守的miRNA，作为肿瘤发生的潜在关键因子而出现。目前的证据表明miR-501在一些恶性肿瘤中过表达，包括肝癌，胃癌和通过促进细胞增殖作为癌细胞起作用的肺癌。此外，miR-501高表达可能是胃癌患者总体生存预测不良的指标。然而，miR-501对宫颈癌的影响和潜在机制尚未探索。
　　CYLD基因位于染色体16q12.1上，编码去泛素化酶。CYLD基因突变与家族性圆筒瘤(FC)，多发性家族性毛发上皮瘤(MFT)和多发性骨髓瘤相关。在肾癌，HCC和子宫颈玻璃状细胞癌细胞系中报道了CYLD的拷贝数减少。同时，在结直肠癌，乳腺癌和肺癌中发现抑制的CYLD基因表达。因此，CYLD被认为是肿瘤抑制剂。此外，据报道，CYLD与IκB激酶(IKK)复合物的组分IKKγ结合并负调节核因子-κB(NF-κB)活性。
　　先前的研究已经证实CYLD是riR-501在肝细胞癌(HCC)细胞中的直接靶标。miR-501通过降低CYLD和增加细胞周期蛋白D1和c-myc表达来增强HCC细胞的增殖。
　　目的:(1)探讨miR-501在子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。
　　(2)确定子宫颈癌中miR-501与CYLD之间的调控关系，揭示miR-501作用的潜在机制。
　　方法:(1)将miR-501模拟物（miR-501组）和无关序列(NC组)、miR-501特异性抑制物（501i组）和无关序列（NCi组）以及针对CYLD的小干扰RNA（siRNA）（siCYLD组）等通过脂质体lipofectamine2000转染至人子宫颈癌HeLa细胞。
　　(2)通过Taqman探针法实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测HeLa细胞中miR-501表达。采用SYBR Green qRT-PCR检测CYLD mRNA表达水平，Western blot检测CYLD、Bcl-2、Bax、NF-κB p65和磷酸化p65(p-p65)蛋白表达。
　　(3)使用CCK-8和克隆形成实验确定miR-501对HeLa细胞增殖的影响。
　　(4)划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验用来确定miR-501在HeLa细胞迁移和侵袭能力中的作用。
　　(5)流式细胞术检测细胞凋亡。
　　结果:(1)Western blot结果显示，与未转染的HeLa细胞（Control组）和NC组相比，miR-501上调（miR-501组）可导致CYLD蛋白显著降低(P＜0.01)，siCYLD组亦显示CYLD表达水平降低(P＜0.01)。实时定量PCR结果显示，miR-501组和siCYLD组CYLD mRNA水平显著低于Control组和NC组(p＜0.01)。与阴性对照组相比，敲低miR-501可导致CYLD的mRNA和蛋白水平显著上调(P＜0.01)。
　　(2)CCK-8实验结果显示，与Control组和NC组相比，miR-50组和siCYLD组细胞增殖显著增加(P＜0.01)。miR-501组（689.3±32.3）和siCYLD组（646.0±29.6）的平均细胞集落计数明显高于Control组（379.0±13.0）和NC组（363.0±13.9）(P＜0.01)。
　　与上调实验结果相反，501i组与阴性对照组相比细胞增殖显著降低（P＜0.05），平均细胞集落计数（207.7±10.7）也显著低于Control组（651.7±15.4），NCi组(644.2±17.6)和口501i+siCYLD组（659.0±21.5）(P＜0.01)。
　　(3)划痕实验结果显示，与对照组和NC组相比，miR-501和siCYLD组伤口面积显著减小(P＜O01)。与之相反，501i组与Control组、NCi组和501i+siCYLD组相比伤口面积较大(P＜001)。Transwell迁移实验结果表明，miR-501组和siCYLD组穿膜细胞数量（99.0±5.6;93.0±3.5）明显高于对照组（30.7±3.3）和NC组（33.3±3.2）。与Transwell迁移实验结果类似，miR-501和siCYLD组（86.4±3.7;81.7±5.0）与对照组(26.7±2.0)和NC组（28.3±1.8）相比，穿膜细胞数明显增多(P＜0.01)。相反，miR-501下调可抑制HeLa细胞穿膜（伴或不伴基质胶）细胞数(P＜0.01)。
　　(4)AnnexinⅤ/Propedium Iodide凋亡检测结果显示，miR-501和siCYLD组(1.55％±0.10％;1.45％±0.05％)细胞凋亡百分比明显低于Control组（2.49％±0.12％）和NC组（2.41％±0.07％）(P＜0.05)。相反地，501i组死亡细胞数（10.65％±0.47％）明显高于Control组（2.47％±0.02％）、NC组（2.39％±0.11％）和501i+siCYLD组(2.19％±0.07％)(P＜0.01)。与Control组和NC组相比，miR-501上调和siCYLD敲低后，Bcl-2、NF-κB p65和p-p65蛋白表达上调，而Bax蛋白表达下调。
　　结论:(1)在子宫颈癌HeLa细胞中miR-501在mRNA和蛋白两个水平下调CYLD表达。
　　(2)miR-501促进子宫颈癌细胞增殖、迁徙和侵袭能力，至少部分是通过下调CYLD和激活下游的NF-κB p65来实现的。
　　(3)miR-501可能是子宫颈癌潜在的治疗靶点。

目录

声明

Table of Contents

摘要

ABSTRACT

1．INTRODUCTION

2．MATERIALS AND METHODS

2．1 Materials

2．1．1 Instruments，Equipments and Reagents

2．1．2 Cell line

2．2 Methods

2．2．1 Cell culture

2．2．2 Cell transfection

2．2．3 RNA Extraction

2．2．4 miR-501 detection by Taqman probe qRT-PCR

2．2．5 SYBR Green dye method qRT-PCR detection of CYLD mRNA

2．2．6 Western Blot analysis

2．2．7 CCK-8 assay

2．2．8 Colony formation assay

2．2．9 Scratch Wound Healing assay

2．2．10 Transwell migration and invasion assay

2．2．11 Annexin V／Propidium iodide apoptosis assay

2．3．Statistical analysis

3．RESULTS

3．2 CYLD is downregulated by miR-501 in cervical cancer cells

3．3 miR-501 improves cell proliferative potential of cervical cancer via downregulating CYLD

3．4 miR-501 promotes the migratory and invasive abilities of cervical cancer cells through downregulating CYLD

3．5．miR-501 inhibits the apoptosis of HeLa cells mediated by the downregulation of CYLD

4．DISCUSSION

CONCLUSION

REFERENCES

LITERATURE REVIEW THE ROLE OF MICRORNA IN CERVICAL CANCER

APPENDIX

Acknowledgment

List of Abbreviations

Dedication

Publication