The role of Sulfatase-1 (Sulf-1) on Hepatocellular Carcinoma lymphatics metastasis cells and its relation with Mesothelin (Msln) gene in Vitro and in

摘要

背景
　　淋巴管可作为肿瘤细胞由原位转移至淋巴结的通道，原位淋巴结是判断肿瘤预后和转移的重要提示。尽管有许多因素被认为与转移过程有关，但关于肝癌淋巴道转移和其通路机制的报道依然较少。肝细胞癌是全球第六大常见肿瘤，其发病率和死亡率位于第三位。2016年有研究报道，75%肝细胞癌在发展中国家被诊断，50%的发病和死亡发生在中国。肝细胞癌以易浸润和转移为特点，其机制涉及许多复杂的分子通路，理解这些致病机制将对有效的抗转移治疗起到帮助。
　　Sulf-1是肿瘤抑制基因，也是一个在多种肿瘤细胞系中起抗转移作用的基因。Sulf-1还被发现能减少多种淋巴道转移因子的表达，这些因子在肿瘤细胞存活、肿瘤生长、侵袭、转移等过程发挥重要作用。Sulf-1通过硫酸乙酰肝素蛋白糖（HSPG）发挥作用，将硫酸肝素链上的6-O-部分移除来抑制所有硫酸肝素依赖信号分子，阻止下游增殖、迁移、侵袭、转移信号激活。
　　Msln在许多肿瘤中是一个肿瘤促进基因，其表达与肿瘤细胞浸润、侵袭和转移相关。Msln的表达可促进 HSPG硫酸化，使之与其受体结合并激活肿瘤生长和转移相关信号通路。
　　本实验室建立了两株同源肝细胞癌细胞株（Hca-F肿瘤淋巴道转移率>75%，Hca-P肿瘤淋巴道转移率<25%），并证明其为研究小鼠肝癌的理想模型。本文发现Sulf-1在Hca-F细胞中表达量较Hca-P细胞中低，而Msln在Hca-F细胞中表达量较 Hca-P细胞中高。因此本文旨在研究：Sulf-1在肝癌转移细胞系中的作用，是否与Msln有关，以及这两个基因是否均依赖HSPG发挥作用。
　　根据本组前期研究，我们提出如下假说：Sulf-1是肿瘤抑制基因，Msln是肿瘤促进基因，在Hca-F细胞中上调Sulf-1将下调Msln并在体内和体外导致淋巴道转移减少，在Hca-P细胞中下调Sulf-1将上调Msln并在体内和体外导致淋巴道转移增多。目前尚无Sulf-1在肝癌淋巴道转移及其与Msln关系的研究，本文是Sulf-1在肝癌淋巴道转移及其与Msln关系的首个研究。
　　目的
　　1.在 Hca-F细胞中稳定上调 Sulf-1基因，检测 Msln表达量的变化，体外细胞增殖、迁移、侵袭的变化，计算体内肿瘤生长率和淋巴结转移率。
　　2.在 Hca-P细胞中稳定下调 Sulf-1基因，检测 Msln表达量的变化，体外细胞增殖、迁移、侵袭的变化，计算体内肿瘤生长率和淋巴结转移率。
　　方法
　　1. Hca-F细胞中使用Sulf-1表达质粒稳定上调 Sulf-1：Hca-F细胞分为三组：（1）Hca-F细胞中加入 Sulf-1表达质粒（Sulf-1-Hca-F），（2）Hca-F细胞中加入非特异序列对照（Nc-Hca-F），（3）无处理Hca-F细胞（Hca-F）。
　　2.在 Hca-P细胞中，分为稳定转染 Sulf-1下调质粒组（shRNA-Sulf-1-Hca-P），非特异序列对照组（shRNA-Nc-Hca-P），未转染组（Hca-P）。
　　3.利用western blot和qRT-PCR技术检测体内和体外稳定转染后，Sulf-1-Hca-F、Nc-Hca-F、Hca-F、shRNA-Sulf-1-Hca-P、shRNA-Nc-Hca-P和 Hca-P细胞中Sulf-1和Msln的表达水平。
　　4.利用血球板人工计数和CCK8法检测细胞增殖。
　　5.利用PI染色和流式细胞术检测细胞周期。
　　6.利用Boyden’s transwell法检测细胞迁移。
　　7.利用内室包被ECM的transwell检测细胞侵袭。
　　8.利用免疫组化技术和苏木素-伊红染色检测基因表达并计算淋巴结转移率。
　　结果
　　体外实验表明在 Hca-F细胞中上调 Sulf-1可在蛋白和 mRNA水平显著下调Msln，并减轻细胞增殖、迁移和侵袭；同时，在 Hca-P细胞中下调 Sulf-1可在蛋白和mRNA水平显著上调Msln，并增强细胞增殖、迁移和侵袭。
　　实验显示，在 Hca-F细胞中上调 Sulf-1时，增值率下降60%，在 Hca-P细胞中下调 Sulf-1时，细胞增殖增加40%。这一现象提示 Sulf-1在肝癌细胞增殖中起主要作用。
　　细胞周期结果显示，在 Hca-F细胞中上调 Sulf-1时，细胞停滞于G0-G1期，同时，S期细胞数减少；在 Hca-P细胞中下调 Sulf-1时，趋势显著不同，G0-G1期细胞减少，S期和G2-M期细胞增多。这进一步验证了Sulf-1在细胞增殖中的作用。
　　同时，Sulf-1上调后的Hca-F细胞的迁移和侵袭显著减少，而 Sulf-1下调的Hca-P细胞迁移和侵袭增多。这些发现提示 Sulf-1在减少肝癌细胞转移方面发挥重要作用。
　　而且，在体实验结果表明，以 Sulf-1上调细胞接种小鼠，其肿瘤生长减少，淋巴结转移率下降至7%（1/4）；在 Hca-P细胞中下调 Sulf-1，肿瘤生长增加，淋巴结转移率上升至78.6%（11/14），此结果印证了Sulf-1在减少肝癌淋巴结转移中发挥重要作用。更进一步，免疫组化结果显示，Sulf-1-Hca-F小鼠淋巴结中肿瘤细胞更少见分裂象和坏死，而 shRNA-Sulf-1-Hca-P小鼠淋巴结中,肿瘤细胞分裂象和坏死组织增多，该结果印证了Sulf-1在淋巴道转移过程中起作用。
　　结论
　　本研究分别在 Hca-F和 Hca-P细胞中上调和下调 Sulf-1，Msln在上调 Sulf-1的Hca-F细胞中表达量减少，在下调Sulf-1的Hca-P细胞中表达量升高。Sulf-1上调的Hca-F细胞增殖显著减少，S期细胞数下降，细胞积于G0-G1期，细胞迁移和侵袭减少；相反，Sulf-1下调的Hca-P细胞增殖增多，S期和G2-M期细胞数显著增加，G0-G1期细胞数显著减少，细胞迁移和侵袭增多。体内实验进一步表明，上调Sulf-1以及随之下调的Msln可延缓肿瘤生长，减少淋巴结转移，而下调Sulf-1以及随之上调的Msln可促进肿瘤生长并增加淋巴结转移。因此推断 Sulf-1是肝细胞癌重要的肿瘤抑制基因，Sulf-1和 Msln的功能相关性可能会为肝癌治疗发现提供新的方法。

目录

声明

CHARTER 1 1. INTRODUCTION

1.1.Molecular pathogenesis of HCC

1.2.The tumor suppressor function of Sulfatase-1 in carcinogenesis

1.3.The tumor promoter function of Msln in carcinogenesis

1.4.Justification of the research

CHAPTER 2 2.MATERIAL AND METHODS

2.1. Materials

2.2. Methods

2.3.Statistical analysis

CHAPTER 3 3. RESULTS

3.1.Western blot and qRT-PCR results for the expression of Sulf-1 and Msln in Hca-F and Hca-P cells bothin vitro.

3.2.Cell Proliferation assay in Hca-F and Hca-P cell linesin vitro

3.3.The role of Sulf-1 on cell cycle in Hca-F and Hca-Pin vitro.

3.4.Theroleof Sulf-1 on cell migration and invasionin vitro.

3.5.In vivoanalysis

3.6.Immunohistochemistry analysis

3.7.Analysis of lymph node metastasisby Histopathological analysis.

CHAPTER 4 4. DISCUSSION

CHAPTER 5 5. CONCLUSION

参考文献

6.LITERATURE REVIEW ：Novel insight into the structure, expression and tumor suppressor function of Sulfatase-1 in carcinogenesis.

6.1. Introduction

6.2.Function of Sulf-1

6.3.Discovery of Sulf-1

6.4.Structure and mechanism of Sulf-1

6.5.Enzymatic specificity of Sulf-1

6.6.Sulf-1 Regulation by methylation

6.7.The role of sulf-1 in cancers

6.8. Conclusion

References:

7.List of Abbreviations

致谢

9. PUBLICATIONS