人EGFR 20ins肺癌类器官及其培养方法、培养基和用途

摘要

本公开涉及一种人EGFR 20ins肺癌类器官及其培养方法、培养基和用途，该方法包括：将取自患者个体的人EGFR 20ins肺癌组织进行酶解，得到肺癌细胞；采用促克隆培养基和基质胶对肺癌细胞进行克隆培养，得到克隆培养产物；取出克隆培养产物中生长较快、具有人EGFR 20ins的克隆细胞；采用扩增培养基和基质胶对克隆细胞进行第一扩增培养，得到扩增培养产物；其中，扩增培养基中含有NSC228155；将扩增培养产物进行第一分离处理，将得到扩增细胞进行第二扩增培养，得到肺癌类器官。本公开的方法培养成功率高、周期短，培养得到的人EGFR 20ins肺癌类器官的稳定性强。

说明书

技术领域

本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种人EGFR 20ins肺癌类器官及其培养方法、培养基和用途。

背景技术

EGFR第20号外显子插入突变（EGFR 20ins），是EGFR基因突变的一种，约占EGFR突变的4-12%。然而，EGFR 20ins结构多变加上检测手段的局限可能导致它们的检出率偏低。除p.A763_Y764insFQEA外，EGFR 20ins通常对第一代和第二代EGFR TKIs不敏感。有试验表明EGF816、AP32788、osimertinib、poziotinib等下一代EGFR TKIs对于EGFR exon20ins突变有很大的临床潜力，并且这些药物已经处于临床发展阶段。但目前针对EGFR exon20ins，还没有通过批准的EGFR TKIs。EGFR20ins由于结构多样性（突变亚型多达200余种），不同的插入可能对EGFR TKIs有不同的应答。因此，在体外建立具有EGFR 20ins突变的细胞模型，对研究个体化用药和靶向药物开发具有重要意义。

研究表明，肿瘤类器官可作为药物筛选模型应用于药物有效性检测，但目前尚无关于肺癌EGFR20ins罕见突变类器官建立方法的报道。

发明内容

本公开的目的是为了提供一种人EGFR 20ins肺癌类器官及其培养方法、培养基和用途，该方法培养成功率高、周期短，培养得到的人EGFR 20ins肺癌类器官的稳定性强。

为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种培养人EGFR 20ins肺癌类器官的方法，该方法包括：

S1、将取自患者个体的人EGFR 20ins肺癌组织进行酶解，得到肺癌细胞；

S2、采用促克隆培养基和基质胶对所述肺癌细胞进行克隆培养，得到克隆培养产物；

S3、取出所述克隆培养产物中的的克隆细胞；

S4、采用扩增培养基和基质胶对所述克隆细胞进行第一扩增培养，得到扩增培养产物；其中，所述扩增培养基中含有NSC228155，所述NSC228155的含量为10~55μM，优选为20~50μM；

S5、将所述扩增培养产物进行第一分离处理，得到扩增细胞；

S6、采用所述扩增培养基对所述扩增细胞进行第二扩增培养。

可选地，所述促克隆培养基含有30~50μM的Y-27632、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM EGF、450~550ng/mL的R-spondin、90~110ng/mL的Noggin、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin；

所述扩增培养基还含有8~12mM的E2、45~55ng/mL的LPS、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM的EGF、15~20μM的bFGF、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin。

可选地，步骤S2中，所述的采用促克隆培养基和基质胶对肺癌细胞进行克隆培养，包括：

将所述促克隆培养基、所述基质胶和所述肺癌细胞进行第一混合，得到原代培养物，其中，以所述促克隆培养基的总体积为基准，所述基质胶的含量为2~10体积%，所述肺癌细胞的浓度为3×10

在36~38℃，CO

可选地，步骤S3中，所述的取出所述克隆培养产物中的克隆细胞，包括：镜下挑取出所述克隆培养产物中直径为50~200μm的第一细胞团，所述第一细胞团具有不规则出芽形态；

将所述细胞团具有不规则出芽形态的细胞团与第一细胞消化液混合，得到第一细胞消化产物；

将所述第一细胞消化产物进行第二分离处理，得到所述克隆细胞。

可选地，步骤S4中，所述的采用扩增培养基和基质胶对所述克隆细胞进行第一扩增培养，包括：

将所述扩增培养基、所述基质胶和所述克隆细胞进行第二混合，得到二代培养物，其中，以所述扩增培养基的总体积为基准，所述基质胶的含量为2~10体积%，所述克隆细胞的浓度为200～500个/mL；

在36~38℃，CO

可选地，步骤S5中，所述的将所述扩增培养产物进行第一分离处理，包括：

将所述扩增培养产物进行第一分离处理，得到细胞沉淀；

将所述细胞沉淀与第二细胞消化液混合，得到第二细胞消化产物；

将所述第二细胞消化产物进行第三分离处理，得到扩增细胞。

可选地，步骤S1中，所述的将取自患者个体的所述人EGFR 20ins肺癌组织进行酶解包括：

将所述人EGFR 20ins肺癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；其中，以所述酶解液为基准，所述酶解液含有2~10体积%的FBS、0.1~0.3体积%的dispase、0.01~0.03体积%的DNAse、1~2mg/mL的Ⅰ型胶原酶，1~1.5体积%的青链霉素；

在36~38℃下对所述待酶解物进行酶解1~2h，得到酶解产物；

将所述酶解产物进行第四分离处理，得到所述肺癌细胞。

本公开第二方面提供一种用于培养人EGFR 20ins肺癌类器官的培养基，所述培养基包括促克隆培养基和扩增培养基；

所述扩增培养基含有10~55μM的NSC228155，优选为含有20~50μM的NSC228155；

优选地，所述扩增培养基还含有8~12mM的E2、45~55ng/mL的LPS、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM的EGF、15~20μM的bFGF、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin；

所述促克隆培养基含有30~50μM的Y-27632、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM EGF、450~550ng/mL的R-spondin、90~110ng/mL的Noggin、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin。

本公开第三方面提供一种采用本公开第一方面提供的方法培养得到的人EGFR20ins肺癌类器官。

本公开第四方面提供一种本公开第三方面提供的人EGFR 20ins肺癌类器官在药物筛选和精准化用药检测中的用途。

通过上述技术方案，本公开提供的培养人EGFR 20ins肺癌类器官方法，通过采用促克隆培养基和含有NSC228155的扩增培养基对人EGFR 20ins肺癌细胞三维培养，可以当对不同的患者进行诊疗时在较短的周期内培养出稳定性强的人EGFR 20ins肺癌类器官，采用培养得到人EGFR 20ins肺癌类器官进行药物筛选，可以针对不同患者个体制定个性化的诊疗方案。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供一种培养人EGFR 20ins肺癌类器官的方法，该方法包括：

S1、将取自患者个体的人EGFR 20ins肺癌组织进行酶解，得到肺癌细胞；

S2、采用促克隆培养基和基质胶对肺癌细胞进行克隆培养，得到克隆培养产物；

S3、取出克隆培养产物中的克隆细胞；

S4、采用扩增培养基和基质胶对克隆细胞进行第一扩增培养，得到扩增培养产物；其中，扩增培养基中含有NSC228155，NSC228155的含量为10~55μM，优选为20~50μM；

S5、将扩增培养产物进行第一分离处理，得到扩增细胞；

S6、采用扩增培养基对扩增细胞进行第二扩增培养。

本公开的发明人意外地发现，采用三维培养的人EGFR 20ins肺癌类器官在形态上与野生型具有区别，克隆形态小且具有不规则的出芽形态，同时NSC228155能够促进人EGFR20ins肺癌类器官细胞的增殖，而对野生型肺癌类器官细胞不具有促进作用。本公开采用促克隆培养基和含有NSC228155的扩增培养基对人EGFR 20ins肺癌细胞培养，培养周期短、成功率高，且培养得到的人EGFR 20ins肺癌类器官稳定性高，可用于解决EGFR 20ins样本缺乏和能够真实反映肺癌患者异质性研究数据缺乏等问题，为肺癌的科学研究、药物筛选、临床治疗等方面提供更加有效、多样的研究模型。

在一种优选的具体实施方式中，扩增培养基中NSC228155的含量为25~50μM，更优选为45~50μM。

根据本公开，对促克隆培养基的种类不做具体限制，示例性地，促克隆培养基可以含有30~50μM的Y-27632（ROCK抑制剂）、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27（细胞培养添加剂）、3~5mM的Nicotinamide（烟酰胺）、15~30μM的EGF（表皮生长因子）、450~550ng/mL的R-spondin、90~110ng/mL的Noggin（重组人头蛋白）、45~55ng/mL的Hydrocortisonum（氢化可的松）、3~8mM的L-glutamine（L-谷氨酰胺）和2~5μM的Insulin（胰岛素）。

根据本公开，扩增培养基中还可以含有其它组分，其它组分可以在较宽的范围内选择，在一种具体实施方式中，培养基中还可以含有8~12mM的E2（雌二醇）、45~55ng/mL的LPS（脂多糖）、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27（细胞培养添加剂）、3~5mM的Nicotinamide（烟酰胺）、15~30μM的EGF（表皮生长因子）、15~20μM的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、45~55ng/mL的Hydrocortisonum（氢化可的松）、3~8mM的L-glutamine（L-谷氨酰胺）和2~5μM的Insulin（胰岛素）。其中，上述各组分均可通过购买获得，各组分的组成、剂型、规格等均是领域内已知的，在此不再赘述。本公开实施例中，将上述各组分进行合理搭配后得到扩增的培养基，采用其与促克隆培养基对人EGFR 20ins肺癌细胞进行三维培养，可以培养得到稳定性良好的人EGFR 20ins肺癌类器官。

在一种具体实施方式中，步骤S2中，采用促克隆培养基和基质胶对肺癌细胞进行克隆培养，可以包括：将促克隆培养基、基质胶和肺癌细胞进行第一混合，得到原代培养物，其中，以促克隆培养基的总体积为基准，基质胶的含量为2~10体积%，肺癌细胞的浓度为3×10

在一种具体实施方式中，步骤S3中，取出克隆培养产物中的克隆细胞，可以包括：取出克隆培养产物中直径为50~200μm、具有不规则出芽形态的细胞团，优选地，在显微镜下采用无菌枪头（例如10~200μL无菌枪头）挑取出直径为50~200μm、具有不规则出芽形态的第一细胞团；将取出的第一细胞团与第一细胞消化液混合进行细胞消化处理，得到第一细胞消化产物；将第一细胞消化产物进行第二分离处理，得到克隆细胞。其中，对第一细胞消化液的种类不做具体限制，第一细胞消化液可以为Trypsin-EDTA Solution、Acctuase等，细胞消化液的用量可以根据实际需要进行选择，优选地，相对于5×10

在一种具体实施方式中，步骤S4中，采用扩增培养基和基质胶对克隆细胞进行第一扩增培养，可以包括：将扩增培养基、基质胶和克隆细胞进行第二混合，得到二代培养物，其中，以扩增培养基的总体积为基准，基质胶的含量为2~10体积%，克隆细胞的浓度为200~500个/mL；在36~38℃，CO

在本申请的一种具体实施方式中，步骤S5中，将扩增培养产物进行第一分离处理，可以包括：将扩增培养产物进行第一分离处理，得到细胞沉淀；将细胞沉淀与第二细胞消化液混合，得到第二细胞消化产物；将第二细胞消化产物进行第三分离处理，得到扩增细胞。对第二细胞消化液的具体种类不做限制，可以与第一细胞消化液相同，对第三分离处理的种类不做限制，例如可以为离心分离处理。

在一种具体实施方式中，步骤S6中，采用所述扩增培养基对所述扩增细胞进行第二扩增培养，直到第二扩增培养的细胞团直径为50~200μm，得到人EGFR 20ins肺癌类器官。

在本申请的一种具体实施方式中，步骤S1中，将取自患者个体的所述人EGFR20ins肺癌组织进行酶解，可以包括：将人EGFR 20ins肺癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；其中，以酶解液为基准，酶解液含有2~10体积%的FBS、0.1~0.3体积%的dispase、0.01~0.03体积%的DNAse、1~2mg/mL的Ⅰ型胶原酶，1~1.5体积%的青链霉素；在36~38℃下，优选在37℃下对待酶解物进行酶解1~2h，得到酶解产物；将酶解产物进行第四分离处理，得到肺癌细胞。

在一种具体实施方式中，该方法还可以包括步骤S7：筛选出与人EGFR 20ins肺癌组织具有相同基因突变类型的所述人EGFR 20ins肺癌类器官。在一种优选的具体实施方式中，对步骤S1中的人EGFR 20ins肺癌组织和经步骤S6得到的肺癌类器官分别进行二代测序，并对比二者的基因突变类型，若突变类型一致，则步骤S6中得到的肺癌类器官即为步骤S1中患者个体的人EGFR 20ins肺癌类器官。

在一种具体实施方式中，步骤S1还可以包括：对患者个体进行手术切除或穿刺得到的人EGFR 20ins肺癌组织，将人EGFR 20ins肺癌组织进行酶解处理，得到肺癌细胞；其中，人EGFR 20ins肺癌组织保存于肺癌组织保护液中，以肺癌组织保护液为基准，肺癌组织保护液含有1~5体积%的Amphotericin B、0.5~2体积%的青链霉素和5~20体积%FBS的RPMI1640。

根据本公开，酶解处理可以包括：将人EGFR 20ins肺癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；其中，以酶解液为基准，酶解液含有2~10体积%的FBS、0.1~0.3体积%的dispase、0.01~0.03体积%的DNAse、1~2mg/mL的Ⅰ型胶原酶，1~1.5体积%的青链霉素；在36~38℃下，优选在37℃下对待酶解物进行酶解1~2h，得到酶解产物；将酶解产物进行第四分离处理，得到肺癌细胞。

本公开第二方面提供一种用于培养人EGFR 20ins肺癌类器官的培养基，所述培养基包括促克隆培养基和扩增培养基；扩增培养基含有10~55μM的NSC228155，优选为含有20~50μM的NSC228155；

在本公开一种优选的具体实施方式中，扩增培养基还含有8~12mM的E2、45~55ng/mL的LPS、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM的EGF、15~20μM的bFGF、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin。

在本公开一种优选的具体实施方式中，促克隆培养基含有30~50μM的Y-27632、5~10μg/mL的两性霉素B、50~100μg/mL的链霉素、1~3体积%的B27、3~5mM的Nicotinamide、15~30μM EGF、450~550ng/mL的R-spondin、90~110ng/mL的Noggin、45~55ng/mL的Hydrocortisonum、3~8mM的L-glutamine和2~5μM的Insulin。

本公开第三方面提供一种采用本公开第一方面提供的方法培养得到的人EGFR20ins肺癌类器官。

本公开第四方面提供一种本公开第三方面提供的人EGFR 20ins肺癌类器官在药物筛选和精准化用药检测中的用途。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得，此外，在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温（20-25℃）。

本公开实施例中所使用的促克隆培养基含有：20μM的Y-27632、10μg/mL的两性霉素B、100μg/mL的链霉素、2%的B27、5mM的Nicotinamide、20μM的EGF、500ng/mL的R-spondin、100ng/mL的Noggin、50ng/mL的Hydrocortisonum、5mM的L-glutamine和4μM的Insulin的DMEM/F12培养基。

本公开实施例中所使用的扩增培养基含有：50μM的NSC228155、10mM的E2、50ng/ml的LPS、10μg/mL的两性霉素B、100μg/mL的链霉素、2%的B27、5mM的Nicotinamide、20μM的EGF、20μM的bFGF、50 ng/mL的Hydrocortisonum、5mM的L-glutamine和4μM的Insulin的DMEM/F12培养基。

本公开实施例中使用的试剂来源如下：

DMEM/F12培养基（货号12634010）、FBS（货号10100147）、LPS（货号0111:B4）B27（货号17504044）、bFGF（货号PHG0360)、Ⅰ型胶原酶（货号 C21900）、L-glutamine（货号25030081）可以购自Gibco，NSC228155（货号113104-25-9）购自APEXBIO，雌二醇(E2)（货号BP1976-EKW）可以购自百奥莱博、EGF（货号4022-500）可以购自BioVision、Y-27632（货号146986-50-7）可以购自MCE、penicillin G-链霉素（货号15070063）可以购自Invitrogen、Nicotinamide（货号98-92-0）可以购自AccuStandard，Matrigel基质胶（货号356234）购自BD。

实施例1

S1、肺癌组织样本的前处理

取临床诊断为EGFR 20ins的肺癌患者手术切除或穿刺得到的人EGFR 20ins肺癌组织，置于预冷的含2体积%的Amphotericin B、1体积%的青链霉素、5体积%的FBS的RPMI1640肺癌组织保护液中，于低温运输条件下，48h内运至实验室处理。

在实验室中将人EGFR 20ins肺癌组织迅速转移至无菌操作台中的100mm

取酶解获得的单细胞悬液，通过70μm细胞筛过滤至无菌离心管中，按照300g离心5min获得细胞沉淀，使用PBS缓冲液清洗后，重复上述步骤，得到人EGFR 20ins肺癌细胞；

S2、向沉淀中加入预冷的含5体积%Matrigel基质胶的促克隆生长培养基（以促克隆培养基的总体积为基准），将细胞浓度调整为3×10

S3、于显微镜下使用10~200μL无菌枪头快速挑取细胞直径在50~200μm、具有不规则出芽形态的细胞团至新鲜配制的扩增培养基中，随后按照300g离心5min将挑取的细胞团富集在15mL无菌离心管中。随后向沉淀中添加1-2mL细胞消化液消化2min，吹打混匀后再次以300g离心5min，获得的细胞沉淀，即为克隆细胞；

S4、向上述获得的克隆细胞中加入预冷的含5体积%Matrigel基质胶的扩增培养基（以扩增培养基的总体积为基准），使用移液器轻轻混合均匀后获得细胞浓度为200~500个/mL的单细胞悬液，按照0.1mL/孔的量缓慢沿板壁加入至96孔板中，待Matrigel基质胶凝固后，沿板壁缓慢补加0.1mL扩增培养基，于37℃、5%CO

S5、按照300g离心5min获得细胞团沉淀，向细胞团沉淀中添加1-2mL细胞消化液消化2min，吹打混匀后再次300g离心5min，得到的细胞沉淀即扩增细胞；

S6、将获得的细胞沉淀按照1：3传代，使用扩增培养基继续培养至细胞团直径达到50~200μm时，收集得到的细胞团即为人EGFR 20ins肺癌类器官；

S7、取经过5次传代细胞活力在85%以上、直径为0.2mm~0.5mm的肿瘤类器官，经采用二代测序方法，对比人源肺癌组织和由该组织来源的人EGFR 20ins肺癌类器官的基因突变情况，若突变情况一致，可判定该人EGFR 20ins肺癌类器官即为步骤S1中患者个体的人EGFR 20ins肺癌类器官。

实施例2

采用与实施例1相同的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，扩增培养基中的NSC228155含量为20μM。

实施例3

采用与实施例1相同的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，扩增培养基中的NSC228155含量为10μM。

对比例1

根据实施例1的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，步骤S4中，所述扩增培养基中不含NSC228155。

对比例2

根据实施例1的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，步骤S2中使用扩增培养基和基质胶对人EGFR 20ins肺癌细胞进行克隆培养，步骤S4中使用促克隆生长培养基和基质胶对克隆细胞进行第一扩增培养。

对比例3

根据实施例1的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，步骤S2中，使用扩增培养基和基质胶对人EGFR 20ins肺癌细胞进行克隆培养。

对比例4

根据实施例1的方法培养人EGFR 20ins肺癌类器官，不同之处仅在于，步骤S4中使用促克隆生长培养基和基质胶对所述克隆细胞进行第一扩增培养对所述克隆细胞进行第一扩增培养。

测试实施例

1、克隆形成检测

根据实施例1-3、对比例1、对比例2、对比例3的培养方法构建的人EGFR 20ins肺癌类器官，分别取经实施例1-3的步骤S7方法鉴定成功的人EGFR 20ins肺癌类器官，分别按照实施例1-3的方法进行扩增培养，培养3天后，于倒置显微镜下随机选择培养板内中间区域的5个视野，计算类器官直径在0.05mm~0.2mm的数量，并收集克隆沉淀，对其酶解后进行细胞计数，统计结果见表1。

表1 人EGFR 20ins肺癌类器官克隆形成情况

由实施例1~3、对比例1~4和表1可以看出，使用培养基不同的情况下，实施例1~3中培养形成的人EGFR 20ins肺癌类器官克隆数量和类器官细胞数量均高于对比例1~4，说明本发明方法能有效促进人EGFR 20ins肺癌类器官的生长。

2、基因突变检测

取临床判定为含有EGFR 20号外显子插入突变的肺癌患者手术组8例，并将其随机分为八份同等大小。按照实施例和对比例方法进行培养后，将得到的第15代细胞采用二代测序技术，分别检测原有突变基因的突变情况，并统计、记录各突变丰度结果，其结果以“M±SD”表示，统计结果见表2。

表2 基因突变丰度统计结果

由表2可以看出，按照实施例1~3的方法培养形成的第15代肺癌类器官，与原肺癌组织相比，其基因突变丰度的依旧与原组织接近，且三种突变基因的检测结果均显示突变丰度的保持情况实施例1＞实施例2＞实施例3＞对比例4＞对比例1=对比例=对比例3，说明本公开的方法能有效维持原组织的基因突变情况。

3、建模成功率比较

取临床判定为含有EGFR 20号外显子插入突变的肺癌患者手术组8例，按照实施例1~3、对比例1~4方法进行人EGFR 20ins肺癌类器官的构建，以能够培养类器官细胞数量达到1×10

表3 不同方法建模的成功率比较

由表3可以看出，按照实施例1的方法培养形成的含有EGFR 20号外显子插入突变肺癌类器官的成功率高达87.5%，与对比例相比，建模成功率实施例1＞实施例2＞实施例3＞对比例4＞对比例1=对比例2=对比例3。

4、传代周期研究

取临床判定为含有EGFR 20号外显子插入突变的肺癌患者手术组8例，按照实施例1~3、对比例4方法进行人EGFR 20ins肺癌类器官构建，以细胞密度达到种植孔的80%作为可传代标准，记录并统计细胞从步骤S4到能够传代所需的时间，其结果见表4。

表4 人肺癌EGFR 20ins突变类器官传代周期

由表4可以看出，按照实施例1的方法培养形成的能在体外连续扩增且含有人EGFR20ins肺癌类器官的平均时间为7.29天，且培养成功所需天数实施例1＜实施例2＜实施例3＜对比例4，说明本公开方法能够在体外短时间内成功建立人EGFR 20ins肺癌类器官。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。