肝吸虫感染致小鼠发病机制的探讨和药物治疗的实验研究

摘要

目的:华支睾吸虫（Clonorchis sinensis,Cs.）又称肝吸虫(Liver fluke)，是一种食源性寄生虫，患者因生食或半生食含有囊蚴的淡水鱼肉而感染，囊蚴在宿主体内发育为成虫，寄生在肝胆管内，引起肝胆管及其周围的炎症病理变化，可诱发黄疸、胆管炎、胆石症、肝胆管周围纤维化等病症。其在全球的流行区域主要集中在中国、韩国、朝鲜、日本、越南及俄罗斯远东等国家和地区。在中国，目前已有1249多万人感染肝吸虫，27个省/市不同程度的存在肝吸虫病流行，以广东省流行最为严重，人群感染率最高达30％，广西和黑龙江感染率也较高，并且肝吸虫病发病率出现上升的趋势。
　　2012年WHO国际癌症研究署将华支睾吸虫正式确定为胆管癌的Ⅰ类致癌物质。胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）在肝胆恶性肿瘤发病率中居第2位，国内胆管癌的发病率亦不断增长。胆管癌是肝吸虫感染所致患者晚期并发症，药物和手术治疗难度大，预后不好，对人体健康危害极大。
　　尽管WHO已明确肝吸虫的致癌作用，但其发病的分子机制尚不十分清楚，还在不断深入研究之中。癌变是一个复杂的过程，肝吸虫致胆管癌是一个多因素、多步骤、多阶段的漫长而复杂的过程。目前学术界普遍认同，肝吸虫导致胆管癌的原因是其在胆管内寄生引起的胆管内皮的机械损伤和随之引起的炎症反应，虫体分泌代谢物的促细胞增殖和毒性作用和基因突变等的共同作用。
　　肝吸虫所引发的宿主长期慢性肝细胞氧化损伤、肝组织纤维化和胆管上皮细胞增生，是导致胆管癌发生的病理基础。肝吸虫感染后可激发宿主免疫应答，引起宿主对虫体和虫卵的炎性反应。为了杀灭外源性物质，被激活的炎性细胞会释放一些活性氧或活性氮类物质，代谢氧自由基的过程中，NADPH、LOX、COX-2是关键酶，它们通过催化花生四烯酸和亚油酸的氧化代谢，消除过量的iNOS。同时纤维结缔组织的增多，实质细胞的减少，不仅导致了正常器官的结构破坏和功能减退，也与癌症的发生有着密切的关系。
　　吡喹酮(praziquantel，PZQ)目前作为临床的一线抗吸虫病药物，具有良好的杀虫能力，是治疗肝吸虫病的首选药物。其药用机制是主要作用于吸虫的Ca2+通道，使其肌肉发生强直性收缩，出现活动度下降，分泌和代谢被抑制;同时由于虫体表面抗原的暴露，依靠机体的免疫细胞作用于虫体，对虫体有抑杀作用。然而，临床上对该药物的抗药性已出现增高的趋势，因此开发新型的抗寄生虫药物（包括抗吸虫药物）已成为目前国内外学者研究的热点问题。沃特曼内酯F(Wortmannilatone F，WF)是一种抑制蠕虫NADH-延胡索酸还原酶系活性的新型抗蠕虫药物，通过抑制电子在线粒体内膜上传递，阻断厌氧氧化磷酸化，破坏蠕虫的呼吸链，影响蠕虫ATP合成，从而导致虫体新陈代谢受阻而死亡。其属于生物类制剂，对哺乳动物的副作用极小，前期实验已经证明该药物对旋毛虫的成虫和囊包具有明显的抑杀作用。
　　趋化因子白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）不仅在免疫调节、抗病原体感染、抑制肿瘤的发生与发展等方面发挥着重要的作用，并且对组织纤维化形成方面有重要的抑制作用。G31P是IL-8类似物，可以竞争性拮抗IL8的分泌和其生物活性，具有拈抗由于寄生虫感染导致的组织严重纤维化，而引发的宿主器官结构和功能的继发性损害的作用，我们的前期实验也证明了这一点。
　　本实验研究分为两部分，第一部分通过肝吸虫感染动物模型的建立，对氧化应激、炎症、纤维化指标及肿瘤标记物的检测，探讨肝吸虫感染引发宿主肝内细胞氧化应激反应的失衡、肝胆管组织纤维化病变，并诱发癌变的过程，以期进一步揭示肝吸虫感染所致病鼠发病的病理机制，以及诱导胆管癌发生的规律。第二部分则从药物抑杀肝吸虫，减轻由肝吸虫感染所造成的病理损害入手，对比用药与否的病理指标变化，来分析药物治疗减少胆管癌发生的可能关系，为今后临床进行药物防治肝吸虫感染（病）提供一定的实验依据。
　　方法:
　　1.动物模型建立
　　1.1 肝吸虫病鼠模型:取102只雄性BALB/C小鼠，体重15-20g，口饲法感染肝吸虫囊蚴，每只鼠接种虫数为70±5个，30天后查粪便，查到虫卵确定建模成功.分离小鼠肝胆管组织和血清（保存于-80℃冰箱），备用。
　　1.2 肝吸虫病兔模型:取1只雄性家兔，口饲法感染肝吸虫囊蚴，感染肝吸虫囊蚴数为1000个左右，30天后查粪便虫卵阳性，麻醉处死，收集其肝胆管中肝吸虫成虫，用于药物体外抑杀肝吸虫实验观察。
　　2.实验分组
　　2.1 动物模型分组:取感染阳性小鼠，随机分感染组、给药组二大组，感染组小鼠用于第一部分的实验研究，给药组小鼠用于第二部分的实验研究。其中感染组又分:第30d组(30d，n=8)、第40d组(40d，n=8)、第50d组(50d，n=8)、第60d组(60d，n=8)、第90d组(90d，n=8)、第180d组(180d，n=8)，每组小鼠8只。给药组又分:吡喹酮组(PZQ，n=18)、吡喹酮联用G31P组(PZQ+G31P，n=18)和Wortmannilatone F联用G31P组(WF+G31P，n=18)三组，在感染后第40d、50d、60d，每组随机取6只鼠进行取材。正常阴性对照组小鼠8只。
　　2.2 肝吸虫体外抑杀实验分组:分别设置吡喹酮组、Wortmannilatone F组和未给药对照组三个组。吡喹酮组:给药浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、500μmol/L;Wortmannilatone F组:给药浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、500μmol/L。每组实验成虫数为20条(n=20)。
　　结果:
　　1.肝吸虫感染致小鼠发病机制的探讨
　　1.1 肝吸虫病鼠肝脏病理变化
　　肝大体病理改变:与对照组比较，感染组的小鼠肝脏肿大，肝边缘部出现多个炎性结节和灰白色囊肿，肝外胆管明显增粗;镜下病理观察发现:肝细胞水肿，汇管区增宽，胆管周围肝细胞部分坏死，出现腺泡样增生，胶原纤维沉积;感染第180d病鼠病灶组织内可见大量的炎性细胞浸润、肝小叶结构出现紊乱和假小叶的形成。
　　1.2 小鼠肝脏胆管周围纤维化水平:肝脏MASSON染色和FSP-1免疫组化结果在与对照组相比，感染组小鼠肝组织中出现较多的胶原纤维;其中感染后第180d组的汇管区出现大量的胶原纤维沉积，并且纤维化程度较高。
　　2.体外药物抑杀肝吸虫的结果观察
　　2.1 虫体活动度和形态:
　　2.1.1 吡喹酮组的成虫经药物作用后，立即出现了强烈的蠕动活动，虫体体积逐渐缩小，活动度减低;在药物作用1h后，虫体头部和体表开始出现了空泡改变。吡喹酮组均在4h开始出现虫体死亡，500μmol/L组死亡虫体为18只;8h时，吡喹酮0.1μmol/L组，虫体死亡9只，0.5、1μmol/L组死亡虫体为12只;24h时，吡喹酮100、500μmol/L组虫体全部死亡;48h时，吡喹酮5、10、50μmol/L组虫体全部死亡;72h时，吡喹酮组所有虫体均死亡。
　　2.1.2 Wortmannilatone F组的肝吸虫在接触药物后，刚开始可见虫体活动度较对照组活跃，但在药物作用12h后，虫体使出现了虫体皱缩，蜷曲，活动度下降。Wortmannilatone F500μmol/L组，培养4h时，出现虫体死亡5只;培养12h时，虫体死亡18只;48h时，虫体全部死亡。Wortmannilatone F100μmol/L组，培养8h时，出现虫体死亡，为2只;培养72h时，虫体全部死亡。WortmannilatoneF0.5、1、5、10、50μmol/L组，培养48h时出现虫体死亡，培养72h时，约一半虫体死亡。
　　2.2 透射电镜结果观察:吡喹酮组肝吸虫可见虫体皮层的基质和线粒体出现肿胀，部分表皮细胞完全溶解，肌纤维出现肿胀。肠壁的上皮层的丝状突起部分出现紊乱，肠上皮细胞层的的内质网、核糖体、线粒体、溶酶体出现肿胀;Wortmannilatone F组肝吸虫皮层的线粒体出现了肿胀，表皮细胞的线粒体、细胞核出现肿胀，肠壁的上皮层的丝状突起出现紊乱和收缩。
　　结论:
　　1.在华支睾吸虫感染过程中，病鼠肝胆管组织长期遭受虫体的机械性和化学性刺激，炎性反应和氧化应激持续发生，COX-2、LOX及IL-6等氧化应激及炎症反应指标呈现先增加后减少的趋势，而纤维化程度及8-OHdG的表达量则持续上升，并且ROS持续存在，促进了肝胆管组织长期的炎症损害和导致肝胆管上皮细胞的增生。
　　2.长期慢性的肝吸虫感染，使得胆管组织癌肿瘤标记物PCNA、CK19的表达量增加，推测在一定程度上促进了胆管上皮细胞的基因突变，导致肝胆管癌的发生。
　　3.Wortmannilatone F对肝吸虫成虫有强效的直接抑杀作用。
　　4.Wortmannilatone F与G31P联合用药，既有抑杀虫体的作用，同时，又有减少肝胆管细胞增殖和纤维化程度，降低胆管癌发生的可能性。
　　5.吡喹酮与G31P联合用药，其杀虫效果未受影响，而且有减少胆管癌发生的可能性
　　6.G31P可拮抗胆管周围组织纤维化的形成，修复虫体对宿主组织造成的损害，同时，亦可能有抑制胆管癌发生的作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 肝吸虫感染致小鼠发病机制的探讨

材料与方法

一、材料

二、实验方法

结果

讨论

第二部分 Wortmannilatone F和G31P联用治疗小鼠肝吸虫病的实验研究

材料与方法

一、材料

二、实验方法

结果

(一)体外药物抑杀肝吸虫的结果观察

(二)联合用药治疗对小鼠感染模型的影响

讨论

(一)药物作用于体外培养的华支善吸虫的情况

(二)联合用药治疗对小鼠感染模型的影响

结论

参考文献

综述 氧化应激反应对肝纤维化形成研究的进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢