实时荧光PCR法检测饲料中反刍动物源性成分

摘要

含有反刍动物源性成分的饲料是疯牛病、羊痒病的主要传播途径，采用实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)对反刍动物源性成分的检测方法已有很多研究，但使用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测模式的研究尚未见报道。本文旨在建立一种使用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测模式和通用引物，且能快速、简便、特异且成本低廉的检测出饲料中反刍动物源性成分的方法，保证进口动物源性饲料的安全，防止疯牛病进入我国。 本文通过对牛、山羊、绵羊和鹿四种动物的线粒体细胞色素b DNA序列的比较，确定了四种反刍动物的共有保守序列，根据此序列设计一段通用特异性扩增引物。在优化的反应体系和反应条件下，采用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测模式，使用通用引物和SYBR Premix Ex Taq<'TM>商品试剂盒对四种动物的模板DNA进行实时荧光PCR扩增反应，对饲料中的反刍动物源性成分进行定性分析，并考察了通过解链温度T<,m>值的差异对检出的反刍动物种类进行区分的可能性。同时还对此方法的特异性、重复性、最低检出限及是否存在引物竞争进行了实验。 实时荧光PCR扩增反应结束后可见，四种反刍动物均有扩增，Tm值均有差异。在特异性实验中，除四种反刍动物产生扩增外，其他常见的可能用于动物源性饲料的动物如鱼、鸡、猪、狗、兔、马均没有产生扩增。在重复性实验中，四种反刍动物的解链曲线Tm值重复性很好，牛、山羊、绵羊和鹿的Tm值分别落在区间82.40±0.026℃、79.95±0.056℃、81.13±0.063℃和79.50±0.063℃之间，相邻两者之间没有交叉。检出限实验得出此方法的最低检出限可达0.001％。引物竞争实验中，两种或两种以上反刍动物的含量相当时，所有动物均可以检测出，但由于鹿和山羊的Tm值相近，两者之间的解链曲线有重叠现象，难以判断，混合样品中含量占优势的成分在扩增中占优势。 本文设计了一段通用特异性扩增引物，可同时对四种反刍动物成分进行特异性扩增。建立了一种采用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测模式，分析解链曲线，根据Tm值判断扩增产物的种类，用于检测饲料中反刍动物源性成分的方法。此方法特异性强，重复性好，灵敏度高，快速简便。此方法可以应用于检测进口动物源性饲料中是否含有反刍动物源性成分，也可以推广至对反刍动物产品的检测，必将有效防止疯牛病进入我国，保证国家安全和人民健康，保护食品和饲料工业的发展。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

1文献综述

2实验部分

2.1引物设计

2.1.1引物设计原则

2.1.2引物设计一般步骤

2.1.3保守区域序列的确定

2.1.4共有保守区域的确定

2.1.5引物设计

2.1.6引物的评价

2.2试剂和设备

2.2.1 DNA提取试剂

2.2.2 PCR反应试剂

2.2.3设备

2.3模板DNA的制备

2.4 PCR反应体系

2.5 PCR反应条件

2.6特异性实验

2.7重复性实验

2.8检出限实验

2.9引物竞争实验

3实验结果与讨论

3.1 DNA提取方法的比较

3.2扩增曲线

3.3解链曲线

3.4特异性实验

3.5重复性实验

3.6检出限实验

3.7引物竞争实验

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

附录

致 谢