费氏丙酸杆菌维生素B生物合成基因的克隆和解析

摘要

维生素B<,12>是一种哺乳动物所必需的维生素，具有广泛的生理学作用，但是哺乳动物自身却不能合成，仅有某些特定的微生物才能合成维生素B<,12>如杆菌，沙门氏菌，丙酸菌和假单胞菌。目前，工业上主要利用脱氮假单胞菌和费氏丙酸杆菌进行维生素B<,12>的生产。由于费氏丙酸杆菌不产生任何毒素，被美国FDA认定为GRAS(Generlly reagard as safe)，其发酵过程能耗低，染菌概率小。因此，费氏丙酸杆菌在维生素B12的发酵生产上占据了越来越重要的地位。为了详尽代谢过程，阐明合成途径，迄今为止，人们已经获得了大部分费氏丙酸杆菌维生素B<,12>生物合成相关的基因，但是，应用费氏丙酸杆菌发酵生产维生素B<,12>的生物合成途径仍不明确。 本研究以费氏丙酸杆菌为出发菌株，克隆、解析了与维生素B<,12>生物合成相关的部分基因。首先，应用遗传互补法，将费氏丙酸杆菌IFO12424株的染色体基因文库，电击转化到Salmonella typhimurium CobⅢ领域的缺失突变株TT10858中，进行P.freudenreichi CobⅢ领域维生素B<,12>生物合成基因的筛选，结果得到了4206bp的DNA片段，命名为P4。解析结果表明，该片段包含了一个部分的和三个完整的读写框，依次为编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶的cobD，编码腺苷钻啉酰胺(AdoCbi)激酶和AdoCbi-P鸟苷酸转移酶的cobU，负责催化AdoCbi-GDP与α-ribazole连接，完成腺苷钴胺素(AdoCbI)最终合成的cobS，及编码转录调节蛋白的cobR。 然后，根据所得cobD的碱基序列，设计相应引物，应用LA PCR<'TM> in vitro Cloning Kit，获得了cobD上游3290bp的序列信息，命名为P3。经序列分析，发现此片段包含了编码钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的cbiA、负责传递腺苷将钴啉胺酸a，c-二酰胺转化生成腺苷钴啉胺酸a，c-二酰胺的cobA，催化腺苷钴啉胺酸a，c-二酰胺酰胺化生成腺苷钴啉胺酸的cbiP以及cobD的上游区域。 最后，将两者合并后得到全长为7308bp的DNA片段，命名为P7。经ORF检索和同源性分析，发现此片段包含了一个部分ORF和5个完整的ORF，依次为cbiP，cobA，cbiA(cbiA-cobD)，cobU，cobS和cobR，它们编码的蛋白负责催化费氏丙酸杆菌发酵生产维生素B<,12>过程中，从钴啉胺酸a，c-二酰胺到最终AdoCbI的生成。因此，发现这些基因为探索费氏丙酸杆菌维生素B<,12>的生物合成途经将具有一定的理论意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

1文献综述

1.1维生素B12简介

1.1.1维生素B12的分子结构

1.1.2维生素B12的生理作用

1.1.3维生素B12的吸收代谢

1.1.4维生素B12的应用与前景

1.2维生素B12的发现过程与来源

1.2.1维生素B12的发现过程

1.2.2维生素B12的来源

1.3维生素B12的生产菌种及发酵生产

1.3.1维生素B12的生产菌种

1.3.2维生素B12发酵生产

1.4维生素B12的生物合成途径

1.5费氏丙酸杆菌维生素B12的生物合成

1.5.1维生素B12厌氧合成过程

1.5.2维生素B12生物合成相关基因

1.6国内外的研究进展

1.7维生素B12发酵生产的发展方向

1.8本论文的研究意义及主要工作

2遗传互补法筛选P.freudenreichii未知的CobⅢ领域的基因

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1实验材料和仪器

2.2.2 S.typhimurium感受态细胞的制备和检测

2.2.3遗传互补法筛选P.freudenreichii的CobⅢ领域的基因

2.2.4同源性检索

2.3结果与讨论

2.3.1遗传互补法筛选P.freudenreichii CobⅢ领域的基因

2.3.2 P4的碱基序列分析

2.3.3讨论

3 P.freudenreichii cobD上游基因的克隆和解析

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料与仪器：

3.2.2准备工作

3.2.3丙酸菌染色体DNA的提取

3.2.4使用Cassette的LA PCR扩增反应

3.2.5目的片段的回收纯化和连接

3.2.6大肠杆菌受体细胞的制备

3.2.7蓝白斑筛选

3.2.8质粒的提取和酶切检测

3.3实验结果与讨论

3.3.1使用Cassette的LA PCR技术克隆cobD的上游基因

3.3.2碱基序列分析

3.3.3讨论

结 论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致 谢