费氏丙酸杆菌离位转化维生素B12的工艺研究

摘要

费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）代谢合成维生素B12（Ado-cbl）的同时，会产生以丙酸为主的副产物，且丙酸对菌体生长具有一定的反馈抑制作用。发酵过程中如何降低丙酸的反馈抑制作用，提高费氏丙酸杆菌发酵的过程经济性是一个至关重要的问题。为了实现费氏丙酸杆菌“边分离、边转化、边发酵”的半连续发酵生产，本研究提出采用细胞离位转化的方式来进行维生素B12的合成，即当发酵进行到某个时间节点时，将菌体细胞从发酵液中分离出来，转移至另一个反应体系中，加入5,6-二甲基苯并咪唑（5,6-Dimethylbenzimida-zole, DMB）进行维生素B12的合成，从而在分批补料发酵的基础上实现费氏丙酸杆菌的半连续发酵。本文首先通过研究代谢中间体脱氧腺苷咕啉醇酰胺（Ado-cbi）与产物维生素B12的关系考察了费氏丙酸杆菌细胞离位转化合成维生素B12的可行性，并从细胞分离时机、分离方式、离位转化体系等方面进行了优化，为费氏丙酸杆菌的半连续发酵双产物耦合分离发酵工艺奠定了前提条件。
　　本研究主要内容包括：⑴优化HPLC检测方法，将洗脱条件改为0-30min，5-24％乙腈梯度洗脱。通过维生素B12转化过程中添加DMB后中间体Ado-cbi与产物维生素B12的关系找到了中间体Ado-cbi的检测峰。使用液-质联用（HPLC-MS）质谱分析测定了检测峰分子质量为1239.3，与中间体Ado-cbi的分子质量一致。由此可以同时而且实时检测代谢中间Ado-cbi以及产物维生素B12。⑵通过对DMB添加时机以及添加量的研究确定了费氏丙酸杆菌转化维生素B12时DMB的最适添加时机为发酵84h，最适添加量为0.9mg/L。研究了发酵初添加DMB策略，DMB补加策略以及DMB连续添加策略，发现转化初期DMB在一定浓度范围内对转化速率有一定影响，发酵初添加DMB会大大降低维生素B12的产量，在转化时以直接添加足量（0.9mg/L）DMB的添加方式为最优。⑶为建立费氏丙酸杆菌的半连续发酵双产物耦合分离发酵工艺，消除DMB添加对菌体细胞生长的不利影响，考察了费氏丙酸杆菌菌体细胞离位转化合成维生素B12的可行性，并优化了其离位转化工艺。确定了最佳离位转化体系为原发酵清液，离位转化最适浓缩倍数为5倍浓缩，离位转化DMB的最适添加量为4.5mg/L，最佳的离位转化温度为30℃以及最适离位转化pH为7.0。维生素B12的产量达到108.06 mg/L，转化效率为2.26mg/(LH)。