苊并杂环类化合物S1在急性髓系白血病中的分子药理机制研究

摘要

Bcl-2(B-celllymphoma-2)家族蛋白是细胞凋亡通路的关键调控因子，包括抗凋亡成员（Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W和A1）与两类促凋亡成员:多域蛋白(Bax、Bak)和BH3-only蛋白(Bom、Puma、Noxa、Bad、Bid、Bmf、Bik和Hrk)。它们之间发生蛋白-蛋白相互作用，调控内源性细胞凋亡通路。研究表明，相当一部分实体瘤细胞和血液肿瘤细胞内源高表达Bcl-2抗凋亡蛋白，因此逃避凋亡，得以永生。例如在急性髓系白血病AML(Acutemyelocyticleukemia)中，Mcl-1(Myeloidcellleukemia-1)的高表达特性是白血病细胞得以持续生长和扩散的关键因子。多域蛋白中的Bax(Bcl-2-associatedxprotein)蛋白和Bak(Bcl-2homologousantago-nist/killer)蛋白是调控内源性细胞凋亡通路的效应因子。它们直接导致线粒体膜通透性增高，促使细胞凋亡。但是，两个效应因子Bax和Bak之间的地位是否等同，机体细胞中存在两个效应因子是否显得冗余，至今仍然存在争论。大多数传统模型表明Bak和Bax在细胞凋亡进程中相互进行补偿。但是在某些情况下，两个蛋白则分别行使各自的功能。
　　Bcl-2蛋白抑制剂通过拮抗Bcl-2促凋亡蛋白，释放Bax和Bak，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤的作用。目前进入临床试验期治疗AML的小分子BH3模拟物包括ABT-737，AT-101，Obatoclax。然而，AML对于ABT-737显示出抗性，因为ABT-737不能够有效的拮抗Mcl-1蛋白。AT-101，Obatoclax虽然能够同时拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，但其诱导凋亡，并不是完全通过依赖Bak/Bax途径，对正常细胞的非特异性毒性，限制了其临床应用。小分子S1是一个我们实验室研究发现的特异性的BH3模拟物。已经证明S1是通过依赖Bax/Bak的内源性凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡，因此S1在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中表现出高效、低毒的优势。尤其是它对Mcl-1蛋白具有很高的亲和力(Ki=58nM)，显著高于已经处于临床试验阶段的同类分子ABT-737。因此，S1可能在ABT-737耐药的AML细胞中发挥高效抗癌活性。
　　本论文的研究目的是探索小分子S1在AML细胞系和原代AML细胞中的抗癌分子药理学机制和肿瘤分子标志物(TumorMarker)，为S1未来的临床试验提供指导。肿瘤分子标志物是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。因此，研究肿瘤标志物对于肿瘤的预防，检测和治疗的意义非常重大。
　　首先，我们将S1作用于三株AML细胞系和二十七例AML患者的原代细胞。通过AnnexinV-FITC-PI双染以及流式细胞仪检测、Caspase检测、免疫共沉淀等实验证明了S1在AML细胞通过内源凋亡通路诱导细胞凋亡，诱导过程完全依赖Bax/Bak蛋白。S1在不同细胞中的敏感性差异很大（EC50范围在500nM-80μM）。通过统计学分析，证明单一Bcl-2家族蛋白的表达量不能作为S1的预测分子标志物，而S1诱导的Bak蛋白的激活量与S1的敏感性线性相关性。最后，通过合成S1衍生物，能促使Mcl-1蛋白的泛素化从而增强Bak蛋白的激活，提高S1在AML中的敏感性。我们的研究确定了S1诱导的Bak蛋白的激活量是S1在AML中的分子标志物。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 细胞凋亡通路是肿瘤生成的关键调节因子

1．3 细胞凋亡途径

1．3．1 外源细胞凋亡通路

1．3．2 内源性细胞凋亡通路

1．4 Bel-2家族蛋白是内源性细胞凋亡途径的顶点和核心因子

1．4．1 Bcl-2家族蛋白的结构特征

1．4．2 Bcl-2家族蛋白调控凋亡的机制

1．5 Mcl-1在Bcl-2家族网络中的作用

1．5．1 Mcl-1是Bak蛋白的“Guard”

1．5．2 Mcl-1蛋白的泛素化

1．5．3 Mcl-1蛋白的磷酸化

1．6 Bcl-2小分子抑制剂

1．6．1 Bcl-2小分子抑制剂的作用机制

1．6．2 特异性Bcl-2蛋白家族小分子抑制剂S1

1．7 肿瘤分子标志物

1．8 本研究工作的指导思想和主要目标

第二章 S1在白血病细胞中的分子药理机制研究

2．1 引言

2．2 实验试剂与设备

2．3 实验方法

2．3．1 细胞的培养及化合物处理

2．3．2 原代急性髓系白血病样品的获得

2．3．3 病人骨髓样品的单个核细胞的密度梯度离心提取

2．3．4 非放射性细胞增殖检测(MTS)

2．3．5 FITC-Annexin V／PI双染色法分析细胞凋亡

2．3．6 Western Blot免疫印记

2．3．7 线粒体膜电位检测

2．3．8 免疫共沉淀实验

2．3．9 S1诱导Bax／Bak蛋白构象激活检测

2．3．10 统计分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 S1通过内源性凋亡途径诱导白血病细胞凋亡

2．4．2 S1依赖Bak／Bax蛋白诱导细胞凋亡

2．4．3 S1在白血病细胞系间具有不同的敏感性

2．4．4 S1在原代AML细胞中具有不同的敏感性

2．4．5 单一Bcl-2家族蛋白表达量不能预测Sl的敏感性

2．4．6 S1诱导凋亡作用与细胞中Bak蛋白释放量线性相关

2．5 本章小结

第三章 S1衍生物在白血病细胞中的分子药理机制研究

3．1 引言

3．2 实验试剂与设备

3．3 实验方法

3．3．1 细胞的培养及化合物处理

3．3．2 免疫共沉淀实验

3．3．3 Western Blot免疫印记

3．3．4 非放射性细胞增殖检测(MTS)

3．4 结果与讨论

3．4．1 S1衍生物4g在K562细胞系中高效诱导细胞凋亡

3．4．2 4g促进Mcl-1的泛素化提高Bak蛋白的释放量

3．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢