特异性卵黄抗体活性片段的制备及性能研究

摘要

特异性卵黄抗体，即卵黄免疫球蛋白(ImmunoglobulinYolk，IgY)，在防治由细菌或病毒感染引起的动物性疾病方面具有安全无残留、不产生抗药性、特异性强等特点，已引起研究者的广泛关注。有研究表明，口服的特异性IgY（在消化道黏液的作用下易被分解）在不与病原菌直接接触的情况下，对细菌感染引起的非消化道疾病起到了显著的治疗作用，据此，研究者推测IgY在体内可能以活性片段的形式与病原菌特异性结合，抑制病原菌在病灶处的定植与繁殖，从而发挥治疗疾病的作用。本研究分别采用体外酶解法和基因工程重组表达法制备特异性IgY活性片段，向其中加入荧光识别位点，以期借助体内荧光示踪技术考察特异性IgY活性片段在体内的走向及分布，从而为研究口服特异性IgY治疗非消化道疾病的作用机理提供实验材料和理论依据。
　　体外酶解法采用嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫蛋鸡，制备IgY及其活性片段。间接ELISA表明，IgY的最高效价可达1∶51200;经两步盐析，IgY的纯度由原来的30.5％提高到62.2％。免疫荧光和体外抑菌实验表明，特异性IgY与嗜水气单胞菌的结合为特异性结合。胃蛋白酶酶解IgY的SDS-PAGE和间接ELISA显示，胃蛋白酶作用于IgY24h能够将IgY彻底分解成Fab'和pFc'碎片;Westernblot和体外抑菌实验结果表明特异性IgY酶解组分中的Fab'为IgY活性片段，其具有显著的体外抑菌性能。
　　基因工程重组表达法以金黄色葡萄球菌为抗原，免疫蛋鸡，采集血液，合成cDNA，根据Genebank报道的鸡IgY可变框架区的序列分别设计IgY重、轻链可变区引物，PCR钓取IgY重、轻链可变区基因，基因测序，结果表明，重链可变区的片段大小约为390bp;轻链可变区均约为330bp。采用生物信息学方法对所得序列与现已报道的相关基因序列进行比较，初步筛选出4条特异性IgY可变区序列，VH2和VH7及VL1和VL4，分别连接pET28a载体，构建重组菌，IPTG诱导，结果发现VH2和VH7的诱导表达成功，且在EcoliBL21中的表达均为胞内可溶性表达;与对照组相比，VH2和VH7均具有显著地结合金黄色葡萄球菌的能力，且VH7的抗原结合活性显著高于VH2(P＜0.05)。采用体外酶解法制备的特异性IgY酶解组分中含非特异组分，这将会干扰后续实验，因此，本研究更倾向于用基因工程重组表达法制备特异性IgY活性片段。
　　综上，酶解法制备的特异性IgY酶解组分中具有体外抑菌活性和抗原结合活性的活性片段为Fab';基因工程重组表达法成功表达出两个特异性IgY活性片段，分别为VH2和VH7。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 IgY的结构与功能

1．2 IgY基因多样性形成的机制

1．3 IgY应用的研究进展

1．3．1 IgY在防治消化道疾病方面的应用研究

1．3．2 IgY在防治非消化道疾病方面的应用研究

1．4 IgY防治细菌或病毒性疾病的作用机理

1．5 功能性小分子抗体片段的研究进展

1．5．1 酶解法制备IgY活性片段的研究

1．5．2 基因工程技术制备小分子抗体的研究

1．6 本论文的研究意义和主要工作

2 特异性IgY及其酶解片段的制备与活性考察

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 试验动物

2．2．2 实验菌株

2．2．3 试剂

2．2．4 实验仪器

2．2．5 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 菌种的活化与保存

2．3．2 灭活疫苗的制备

2．3．3 蛋鸡的免疫

2．3．4 鸡蛋的收集及水溶性组分的提取

2．3．5 血清的制备和抗原最佳包被浓度的确定

2．3．6 特异性IgY效价水平的检测

2．3．7 IgY的分离与纯化

2．3．8 分离纯化各阶段IgY的纯度检测

2．3．9 IgY对病原菌的生长抑制作用

2．3．10 IgY与病原菌的特异性结合活性

2．3．11 IgY对胰蛋白酶的稳定性

2．3．12 酶解法制备IgY活性片段

2．3．13 IgY酶解片段对病原菌的生长抑制

2．3．14 Western检测IgY活性片段

2．3．15 统计学分析

2．4 结果与分析

2．4．1 抗原最佳包被浓度的确定

2．4．2 特异性IgY抗体效价水平的检测

2．4．3 分离纯化IgY各阶段的SDS-PAGE

2．4．4 特异性IgY对病原菌的生长抑制作用

2．4．5 特异性IgY与病原菌特异性结合活性的考察

2．4．6 IgY对胰蛋白酶的稳定性考察

2．4．7 胃蛋白酶酶解法制备IgY活性片段

2．4．8 特异性IgY活性片段对病原菌的生长抑制作用

2．4．9 Western blot确定IgY酶解组分中的活性片段

2．5 小结

3 特异性IgY活性可变区基因的钓取与原核表达

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物

3．2．2 菌株、克隆载体

3．2．3 主要试剂

3．2．4 仪器

3．2．5 溶液的配制

3．3 实验方法

3．3．1 金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备

3．3．2 蛋鸡的免疫及血液的采集及其效价的检测

3．3．3 IgY可变区VH和VL基因文库的构建

3．3．4 VH和VL序列的测定与引物的设计

3．3．5 IgY可变区目的基因的原核表达

3．3．6 表达产物的可溶性鉴定

3．3．7 表达产物的活性鉴定-间接ELISA

3．3．8 数据分析

3．4 结果

3．4．1 免疫血清的效价

3．4．2 总RNA的纯度的检测

3．4．3 IgY重轻链可变区的扩增与纯化

3．4．4 重组质粒的连接、转化与PCR鉴定

3．4．5 目的基因的酶切鉴定

3．4．6 重组质粒pET28a-目的基因的连接、转化与鉴定

3．4．7 重组质粒的提取、转化与鉴定

3．4．8 IgY重、轻链可变区的诱导表达

3．4．9 重组蛋白可溶性表达的鉴定

3．4．10 重组蛋白的抗体活性检测

3．5 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢