母体孕期DEHP暴露对子代小鼠性别发育的干扰机制

摘要

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(DEHP)作为增塑剂，广泛应用于食品和化妆品包装材料、医用材料等领域。流行病学调查数据表明，DEHP暴露引起了哺乳动物多种生殖发育损伤，其中精液质量下降最为显著。动物实验研究表明，DEHP能够通过抗雄激素方式，干扰雄性大鼠的生殖发育，但人类和小鼠雄性中存在DEHP诱导的性激素干扰的抗性。DEHP孕期暴露造成的人类和小鼠后代生殖发育损伤具有非性激素依赖性，但机制不明确。此外，DEHP孕期暴露诱导的雌性后代生殖发育毒性及其机制尚不明确。
　　本论文的研究目的是基于性别决定调控过程紊乱，阐明孕期DEHP暴露对雄性和雌性仔鼠的生殖发育损伤的分子机制。将ICR小鼠孕鼠灌胃染毒DEHP，染毒剂量包括人类暴露相关剂量。研究DEHP对胚胎期性别决定调控通路关键基因表达时序和表达量的影响。并进一步研究胚胎期DEHP暴露对仔鼠出生后支持细胞和颗粒细胞分化、性激素合成和性腺组织学影响。主要研究内容和结果如下:
　　(1)孕期DEHP暴露对于雄性性别决定调控通路关键基因的影响。采用实时定量PCR和整胚原位杂交(WISH)方法检测了胚胎期10.5-13.5 d性别决定调控通路关键基因表达量的变化。结果显示:2-700 mg/kg/d DEHP孕期暴露扰乱了Y染色体上性别决定因子基因(Sry)精确时序性表达，并延迟了其表达量到达阈值的时间。700 mg/kg/d DEHP暴露使得Sry在性别决定关键窗口期的表达下降了2.5倍。支持细胞分化决定因子睾丸特异性转录因子Sry相关基因9(Sox9)在整个性别决定期的表达均受到显著抑制，并且11.5dpc时，700 mg/kg/d DEHP暴露导致Sox9表达量下降了5倍。雄性性别决定调控通路中Sry上游基因生长阻滞及DNA损伤诱导45γ基因(Gadd45g)和锌指转录因子基因4(Gata4)的表达显著抑制。WISH与RT-qPCR结果一致，证明性别决定关键窗口期Sry时序性表达的紊乱。结果提示2-700 mg/kg/d DEHP显著抑制胚胎雄性决定通路在11.5dpc的开启，涉及的通路为:Gadd45g→Gata4/Fog2→Sry→Sox9→Fgf9。
　　(2)孕期DEHP暴露对雄性仔鼠出生后支持细胞分化和睾丸组织学影响。利用RT-qPCR检测了出生后第1天(PND1)和第21天(PND21)雄性仔鼠中支持细胞分化维持和增殖标志基因Sox9和成纤维细胞生长因子9(Fgf9)的表达变化，以及类固醇激素合成急性调节蛋白基因(Star)和胆固醇侧链裂解酶基因(Cyp11a1)的表达变化;利用蛋白质印记(Western blot)法检测了仔鼠睾丸中支持细胞标志因子SOX9和FGF9,同时检测了参与支持细胞对生殖细胞分化发育调控的关键蛋白Double-sex和Mab-3转录因子1(DMRT1)的水平;通过组织病理学分析检测了PND21仔鼠睾丸组织学变化。结果显示:2-200 mg/kg/d DEHP孕期暴露显著抑制PND1和21仔鼠睾丸Sox9和Fgf9表达，同时SOX9、FGF9和DMRT1的表达水平显著下降。200 mg/kg/d DEHP孕期暴露组中，这三种蛋白的表达水平分别下降了1.5、3和2倍。表明雄性睾丸支持细胞分化和增殖受损，将会导致精子生成障碍。Star和Cyp11a1的表达未受到显著影响，证明仔鼠雄性激素生成未受显著影响。PND21仔鼠睾丸出现了生精小管内支持细胞和生殖细胞缺失。结果表明，孕期DEHP暴露造成雄性小鼠出生后支持细胞分化和功能损伤，进而导致精子生成受阻，对性别决定调控通路的干扰是其非性激素依赖机制之一。
　　(3)孕期DEHP暴露对于雌性性别决定调控通路关键基因的影响。利用RT-qPCR和WISH方法检测了雌性胚胎期11.5-13.5 d时，雌性性别决定调控通路关键基因表达量的变化。结果显示:2-200 mg/kg/d DEHP显著上调了雌性胚胎性别决定调控关键基因叉头状转录因子基因2(Foxl2)、无翼乳房肿瘤病毒相关整合位点4(Wnt4)、β链蛋白(β-catenin)和卵泡抑制素(Fst)的表达，并且11.5 dpc时，200 mg/kg/d DEHP暴露导致这些基因的表达量分别升高了1.7、1.5、1.6和1.8倍。提示胚胎期雌性颗粒细胞分化和发育过程受到干扰。WISH与RT-qPCR结果一致，证明Wnt4表达上调。结果表明DEHP孕期暴露能够通过异常激活雌性胚胎性别发育通路干扰雌性性别发育。
　　(4)孕期DEHP暴露对雌性仔鼠出生后卵巢分化和组织学影响。利用RT-qPCR检测了PND1和21雌性仔鼠中颗粒细胞分化和卵泡发育调节基因Foxl2和Fst的表达，以及Star和Cyp11a1的表达变化;利用Western blot检测了PND21仔鼠卵泡发育调控蛋白FST的水平;通过组织病理学分析检测了PND21仔鼠卵巢组织学变化。结果表明:2-200 mg/kg/d DEHP孕期暴露显著升高了PND1和21雌性仔鼠卵巢中Foxl2表达，同时Fst表达被显著抑制，而200 mg/kg/d DEHP暴露导致PND21仔鼠卵巢FST表达水平下降了3倍。表明颗粒细胞分化维持的损伤和卵泡发育进程紊乱。与雄性不同，Star和Cyp11a1的表达受到显著抑制，提示出生后仔鼠雌性激素生成受到影响。雌性PND21仔鼠卵巢髓质部卵泡闭锁明显增加，表明卵巢发育进程提前。结果表明，DEHP可通过异常激活雌性性别决定通路，诱导雌性仔鼠颗粒细胞分化和功能异常，进而干扰卵泡发育进程，导致卵泡闭锁的提前和卵巢的过早发育。
　　综上，2-700 mg/kg/d DEHP孕期暴露显著干扰了雄性性别决定基因Sry精确表达的时序性表达，性别决定调控通路Gadd45g→Gata4/Fog2→Sry→Sox9→Fgf9受干扰，导致雄性仔鼠出生后支持细胞分化发育异常和精子生成障碍。提示干扰胚胎期性别决定调控过程是DEHP雄性生殖发育毒性的重要非性激素依赖性机制。同时，2-200 mg/kg/dDEHP诱导雌性胚胎期性别决定调控通路上关键因子Foxl2、Fst、Wnt4和β-catenin表达上调，导致雌性发育通路异常激活，诱导仔鼠颗粒细胞分化和功能异常以及卵泡发育提前。本论文揭示了DEHP新的雄性和雌性生殖发育毒性作用的潜在机制，为邻苯二甲酸酯类化学品的健康风险评价提供科学依据，结果有助于阐明该类环境内分泌干扰物暴露与野生哺乳动物及人类的生殖障碍之间的关联。

目录

声明

摘要

缩写表

1 绪论

1．1 邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)的研究概况

1．1．1 DEHP的理化性质及应用

1．1．2 DEHP的环境污染

1．1．3 DEHP的环境迁移转化行为

1．1．4 DEHP人体暴露途径和摄入量

1．1．5 DEHP体内代谢与组织分布

1．1．6 DEHP的毒性效应

1．2 哺乳动物性别决定调控的分子机制

1．2．1 生殖嵴的形成

1．2．2 性别特异性基因的表达和级联调控

1．2．3 性腺结构的特化

1．3 本文主要研究思路

1．3．1 选题依据

1．3．2 研究目的与意义

1．3．3 研究内容

2 孕期高剂量DEHP暴露对雄性胚胎性别决定调控通路关键基因表达的影响

2．1 实验部分

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．3 实验动物和染毒方式

2．1．4 小鼠胚胎性别鉴定

2．1．5 利用实时RT-qPCR检测生殖嵴中性别决定调控通路关键基因的表达

2．1．6 Sry探针的构建

2．1．7 地高辛标记Sry探针

2．1．8 斑点杂交法检测Sry探针质量

2．1．9 胚胎生殖嵴整胚原位杂交

2．2 数据处理

2．3 结果

2．3．1 高剂量DEHP孕期暴露对Sry时序性表达的影响

2．3．2 高剂量DEHP孕期暴露对雄性性别决定调控通路基因表达的影响

2．4 讨论

2．5 小结

3 孕期环境相关剂量DEHP暴露对胚胎雄性性别决定调控通路基因表达的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 仪器与试剂

3．1．2 实验动物和染毒方式

3．1．3 仔鼠生殖嵴的收集

3．1．4 小鼠胚胎性别鉴定

3．1．5 RT-qPCR检测性别决定调控通路关键基因的表达

3．1．6 Sox9探针的构建

3．1．7 地高辛标记Sox9探针

3．1．8 斑点杂交法检测Sox9探针质量

3．1．9 整胚原位杂交检测雄性生殖嵴中Sox9的表达

3．2 数据处理

3．3 结果

3．3．1 孕期DEHP暴露对雄性胚胎Sox9和Fgf9表达的影响

3．3．2 孕期DEHP暴露对Sox9上游调控基因表达的影响

3．4 讨论

3．5 小结

4 孕期DEHP暴露对雄性仔鼠出生后支持细胞分化和睾丸组织学的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 仪器与试剂

4．1．2 实验动物和染毒方式

4．1．3 仔鼠睾丸组织的收集

4．1．4 仔鼠睾丸形态学分析

4．1．5 RT-qPCR检测出生后仔鼠Sox9、Fgf9及Star和Cyp11a1的表达量

4．1．6 Western Blot检测SOX9、FGF9和DMRT1的表达量

4．2 数据处理

4．3 结果

4．3．1 孕期DEHP暴露对母鼠体重增长的影响

4．3．2 孕期DEHP暴露对仔鼠善丸组织学的影响

4．3．3 孕期DEHP暴露对仔鼠支持细胞分化标志物的影响

4．3．4 孕期DEHP暴露对仔鼠Star和Cyp11a1表达的影响

4．4 讨论

4．5 小结

5 孕期DEHP暴露对雌性胚胎性别发育调控通路基因表达及出生后卵巢分化和组织学的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 仪器与试剂

5．1．2 实验动物和染毒方式

5．1．3 仔鼠生殖嵴及卵巢组织的收集

5．1．4 仔鼠卵巢形态学分析

5．1．5 小鼠胚胎性别鉴定

5．1．6 利用实时RT-qPCR检测生殖嵴中性别决定调控通路关键基因的表达

5．1．7 Wnt4探针的构建

5．1．8 地高辛标记Wnt4探针

5．1．9 斑点杂交法检测Wnt4探针质量

5．1．10 利用整胚原位杂交法检测胚胎雌性生殖嵴中Wnt4的表达

5．1．11 Western Blot检测卵巢中FST的表达量

5．2 数据处理

5．3 结果

5．3．1 孕期DEHP暴露对胚胎雌性性别决定调控通路关键基因表达的影响

5．3．2 孕期DEHP暴露对仔鼠卵巢发育维持和卵泡发育因子表达的影响

5．3．3 孕期DEHP暴露对仔鼠性激素合成关键酶类基因表达的影响

5．3．4 孕期DEHP暴露对仔鼠卵巢组织学的影响

5．4 讨论

5．5 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢