基于海参养殖水体净化的益生菌筛选与应用

摘要

集约化高密度的海参养殖方式导致养殖水体污染日益严重。微生态制剂因其实用性强、成本低、收益大、操作简易、不易形成二次污染等诸多优势在养殖业广泛应用，但也存在菌剂的专一性不强、不适宜海洋环境、活菌数降低、菌株配伍不适等问题。鉴于此现状，本研究筛选了适应海洋环境的益生菌，对其生长特点、对以弧菌为主的病原菌群的抑制作用及其对养殖水体的净化能力进行研究。根据各单菌特点，构建复合菌群，开发新型微生态制剂，减少海参腐皮病的发生，解决海参养殖过程中的水体污染问题。 首先，从A、B、C三组液态样品及海参养殖池塘底泥样品中筛选出的8株益生菌，经生理生化实验及16S rRNA基因测序分别确定为：Lactobacillus buchneri Y1、Acetobacter pasteurianus Y2、Sphingomonas sp.Y3、Lactobacillus casei Y4、Bacillus subtilis Y5、Bacillus velezensis Y6、Kerstersia gyiorum Y7、Pediococcus pentosaceus Y8。考察了8株菌与海洋来源的Bacillus subtilis DL11-11在基础培养基及简化海水培养基中的菌体浓度及活菌数变化规律并对其生长参数进行动力学分析，Acetobacter pasteurianus Y2极不适宜用简化海水基培养，其他海洋益生菌均可用简化海水培养基培养，特别是Sphingomonas sp.Y3、Lactobacillus casei Y4、Bacillus subtilis Y5、Bacillus velezensis Y6。 其次，从高温爆发后海参养殖池塘水样中富集病源菌群且经TCBS选择性培养基筛选并纯化，确定病源菌群中主要由Vibrio alginolyticus strain和Vibrio parahaemolyticus strain组成，为我国海域常见的海参腐皮病的致病菌。纸片法确定了Y2、Y4、Y5、Y6、Y8和DL11-11对病原菌有明显抑制作用。 随后，比较了培养基对海洋益生菌净化水质的能力的影响。基础培养基培养，Kerstersia gyiorum Y7亚硝态氮去除效率最高，为2.62mg/L·d·108cfu。Bacillus subtilis DL11-11的氨氮去除效率最高，为0.11mg/L·d·108cfu。Kerstersia gyiorum Y7的COD去除率最高。经简化海水培养基培养后，Sphingomonas sp.Y3亚硝态氮去除效率及氨氮去除效率最高，分别为3.82mg/L·d·108cfu、0.37mg/L·d·108cfu，同时COD去除率高。 最后，根据前期对各海洋益生菌在基础培养基以及简化海水培养基中的生长特点及其相互作用、对病原菌群的抑制作用以及对氨氮、亚硝态氮、COD、浊度的影响设计两组不同的菌种组合。其中，基于基础培养基实验结果设计的4号复合菌群（Y1∶Y3∶Y4∶Y5∶DL11-11=5∶3∶3∶2∶1）通过基础培养基培养后，投入养殖废水后能有效降低氨氮、亚硝态氮及COD，且亚硝态氮去除效率和氨氮去除率最高，其中亚硝态氮去除效率可达3.35mg/L·d·108cfu，较单菌处理可达到的最高去除效率（Kerstersia gyiorum Y7）提高了27.86%；氨氮去除效率可达0.14mg/L·d·108cfu，较单菌处理可达到的最高去除效率（Bacillus subtilis DL11-11）提高了27.27%。基于简化海水培养基实验结果设计的B组合（Y1∶Y3∶Y4∶DL11-11=3∶1∶1∶5）能有效降解亚硝态氮及COD，A组合（Y3∶Y4∶Y5∶Y6∶Y7=2∶5∶3∶3∶5）能有效降解亚硝态氮及氨氮。但在亚硝态氮去除效率方面，A、B组合区别不大，处理5天的平均去除效率均可达4.26mg/L·d·108cfu，较单菌处理可达到的最高去除效率（Sphingomonas sp.Y3）提高了11.52%，较4号复合菌群提高了27.16%。A组合氨氮去除效率可达0.40mg/L·d·108cfu，较单菌处理可达到的最高去除效率（Sphingomonas sp.Y3）提高了8.10%，较4号复合菌群提高了1.86倍，效率差异明显。可见，适应海洋环境的益生菌在水质净化方面较淡水培养的益生菌具有显著优势。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 海参养殖现状

1.1.1 海参养殖

1.1.2 海参养殖常见病症

1.1.3 养殖水体恶化指标及其危害

1.1.4 常规的水体改良方法

1.2 微生态制剂

1.2.1 微生态制剂常用菌种

1.2.2 微生态制剂作用机理

1.2.3 微生态制剂存在问题

1.3 本课题的研究思路

1.3.1 本课题的研究内容

1.3.2 本课题的研究意义

2.1 引言

2.2 实验材料及仪器

2.2.2 培养基

2.2.3 实验试剂

2.2.4 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 实验流程

2.3.2 分析方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 海洋益生菌的筛选结果

2.4.2 生长曲线及OD600-活菌数拟合曲线的绘制

2.4.3 病源菌群的富集

2.4.4 海洋益生菌对病源菌群的抑制作用

2.4.5 海洋益生菌之间的相互作用

2.5 本章小结

3 海洋益生菌单菌对海参养殖水体净化的影响

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 实验流程

3.3.2 分析方法

3.4 结果与讨论

3.4.1 Lactobacillus buchneri Y1对水体净化的影响

3.4.2 Acetobacter pasteurianus Y2对水体净化的影响

3.4.3 Sphingomonas sp. Y3对水体净化的影响

3.4.4 Lactobacillus casei Y4对水体净化的影响

3.4.5 Bacillus subtilis Y5对水体净化的影响

3.4.6 Bacillus velezensis Y6对水体净化的影响

3.4.7 Kerstersia gyiorum Y7对水体净化的影响

3.4.8 Pediococcus pentosaceu Y8对水体净化的影响

3.4.9 Bacillus subtilis DL11-11对水体净化的影响

3.5 本章小结

4 复合菌群对海参养殖水体净化的影响

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验菌种

4.2.2 培养基

4.2.3 实验试剂

4.2.4 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 实验流程

4.3.2 分析方法

4.4 结果与讨论

4.4.1 基础培养基培养条件下的菌群设计

4.4.2 基础培养基培养条件下的复合菌群对养殖水体净化的影响

4.4.3 简化海水培养基培养条件下的菌群设计

4.4.4 简化海水培养基培养条件下的复合菌群对养殖水体净化的影响

4.4.5 复合微生态制剂的水质净化效果评价

4.5 本章小结

结论

展望

参考文献

致谢

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