Lactococcus lactis食品级诱导表达系统构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达

摘要

乳酸菌是在食品、医药等领域广泛应用的微生物，用乳酸菌构建以非抗生素抗性为选择标记的食品级载体的研究越来越为人们所关注。 NICE(TheNisin-Controlled Expression)系统是有效的食品级诱导表达系统。乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因的表达，含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的，构建乳酸菌NICE系统食品级表达载体，将集益生菌生物功能和外源基因表达产物活性于一体，在食品和医药方面有着很好的应用前景。 在目的蛋白生产和发酵中，由于乳酸菌分泌表达可使乳酸菌生产的异源蛋白质前体避免水解，异源蛋白质表达量更高，以同源的乳酸球菌SPUsp45指导目的蛋白的分泌表达并且目的基因与SPUsp45，Nuc和LEISSTCDA的融合体可提高分泌表达效率，因而乳酸菌分泌表达更有意义。 本研究利用食品级a-aga选择标记代替抗生素抗性选择标记，并利用nisA启动子、nisR、nisK和SPUsp4s/nucA/cwaM6/t1t2基因，以乳酸球菌作为宿主菌，以乳链菌肽作为诱导分子，构建更为安全稳定的乳酸菌食品级高效诱导细胞质和细胞分泌表达的θ型复制载体系统。OprF/H为本实验室构建，是铜绿假单胞菌外膜蛋白组分F和H的融合蛋白，具有良好的免疫原性，为检测该系统的可行性，将OprF/H基因克隆入构建的载体中，在乳酸球菌中进行高效诱导细胞内和细胞壁分泌表达，为利用此两种载体表达各种外源性和内源性的功能基因提供理论和技术依据，同时也为研制有效的防治铜绿假单胞菌的新型疫苗提供思路。 从L.lactisSMQ719/pRAF800中提取到食品级载体pRAF800，根据公布的pRAF800的复制子序列，设计引物扩增rep基因，经限制酶EcoRⅠ和NheⅠ酶切，利用T4连接酶与pMG36e的Emr连接。连接产物用电转化法转入L.lactisNZ9000中，经Em筛选、克隆子鉴定，获得重组质粒pEmr∶rep。用限制酶HindⅢ酶切pEmr∶rep，pEmr∶rep经绿豆核酸酶削平，T4连接酶连接，获得含Emr的θ复制子缺失载体pEmr∶Arep。 然后以pNZ8048DNA为模板，根据已发表的PnisA和TpepN序列，设计引物扩增出大小为312bp的PnisA-MCS-TpepN基因片段，再用限制酶XbaⅠ酶切pRAF800和PnisA-MCS-TpepN基因，用T4连接酶将PnisA-MCS-TpenN基因与去磷酸化的线性pRAF800进行连接，用电转化法将连接产物转入L.lactisNZ9000感受态细胞中，在Mel-EL1和Mel-BCP培养基中进行扩增培养，根据a-aga酶特殊代谢底物-蜜二糖的食品级显性选择标记筛选阳性克隆子并进行克隆子鉴定，获得含有a-aga和PnisA-MCS-TpepN的乳酸球菌食品级细胞内诱导表达载体，命名为pRNA48，其大小为4.5kb。以同样方法在pRAF800的XhoⅠ位点上克隆入PnisA-MCS-TnepN获得另一食品级载体pRNB48。 以pVE5524为模板，根据已公布的SPUsp4s和t1t2的序列设计引物扩增出SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2片段，扩增产物经NcoⅠ和NheⅠ酶切，用T4连接酶与经NcoⅠ和NheⅠ限制内切酶酶切并去磷酸化的线性pRNA48连接，用电转化法将连接产物转入L.lactisNZ9000感受态细胞中，经Mel-EL1和Mel-BCP培养基中进行扩增培养、筛选和克隆子鉴定，获得含有a-aga和PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2的乳酸球菌食品级高效诱导分泌表达载体，命名为pRNV48，其大小为6.0kb。利用nisin诱导L.lactisNZ9000/pRNV48分泌表达Nuc，使Nuc靶定到细胞壁上，表达产物经SDS-PAGE分析，结果显示表达的Nuc在1ng/mLnisin诱导3小时后达到峰值，经TB-D平板检测，表达产物是具有活性的Nuc。 为检测构建的表达载体pRNA48和pRNV48是否可以高效诱导表达外源基因，根据已知序列设计引物扩增出OprF/H基因，并将其克隆入载体pRNA48和pRNV48中，用电转化法将重组载体转入L.lactisNZ9000中，经食品级选择标记a-aga筛选和克隆子鉴定，获得重组载体pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸球菌菌株的诱导表达，表达产物经SDS-PAGE，Westen-blot分析，以及与相应抗原的凝集反应证明，表达产物具有活性，表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6％和细胞壁锚定蛋白的9.8％。 主要工作包括： 1.构建了含Emr的θ复制子缺失载体pEmr∶△rep。 2.成功构建了食品级载体pRNA48和pRNV48，可在乳酸球菌L.lactisNZ9000中进行θ型复制，并与L.lactisNZ9000宿主菌共同构成乳酸球菌NICE系统食品级胞内和分泌表达系统。 3.构建的系统在nisin的诱导下，在胞内表达了OprF/H融合蛋白，表达产物经SDS-PAGE检测，分子量为55KDa，当诱导时间3h，nisin终浓度为10ng/mL时，表达量达到最高值，占胞内可溶蛋白的9.6％。经Westen-blot检测为活性蛋白。 4.构建的系统在nisin的诱导下，成功地将OprF/H融合蛋白锚定在细胞壁上，表达产物经SDS-PAGE检测，分子量为58KDa，最高产量占细胞壁锚定蛋白的9.8％。经Westen-blot检测为活性蛋白。 本研究构建的食品级载体可作为口服疫苗或功能性蛋白的传递载体。

目录

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摘要

缩略语表

第一章文献综述

第二章乳酸菌两组分食品级选择标记复制子缺失质粒的构建

第三章乳酸菌两组分食品级诱导表达系统载体的构建

第四章乳酸菌两组分食品级诱导表达系统分泌表达载体的构建

第五章细胞内表达载体pRNA48-OprF/H的构建及细胞内表达初步研究

第六章分泌表达载体pRNV48-OprF/H的构建、锚定表达以及表达蛋白的活性检测

第七章主要研究结果和建议

参考文献：

个人简历

攻读博士学位期间发表及被录用论文目录

致谢

附录