抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备与应用

摘要

牛乳中β-乳球蛋白是一种主要的过敏原，大约有60％牛乳过敏人群对β-乳球蛋白过敏。牛乳β-乳球蛋白与水牛乳β-乳球蛋白存在免疫交叉反应，对牛乳β-乳球蛋白过敏的人群也可能对水牛乳β-乳球蛋白过敏。因此，从食物过敏的角度探索水牛乳β-乳球蛋白具有一定理论价值。另外，由于水牛乳消费人群逐渐增加，为了保护过敏患者的健康，开展水牛乳的过敏研究将具有重要现实意义。 本研究的主要内容包括水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化、兔抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备以及水牛乳β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立。 在水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化过程中，建立了DEAE-Sepharose FastFlow离子交换结合Sephadex G-75凝胶层析分离纯化水牛乳β-乳球蛋白的方法。SDS-PAGE和IEF-PAGE鉴定结果表明，两种方法结合可以分离得到纯度>90％的水牛乳β-乳球蛋白。 在抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备过程中，建立了间接ELISA检测水牛乳β-乳球蛋白抗血清效价的检测方法及制备抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的程序。免疫2只日本大白兔分别获得了间接ELISA检测效价高达1:204800和1:102400及双向琼脂扩散检测效价均为1:16的抗血清。通过双向琼脂扩散试验证实了水牛乳β-乳球蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在免疫交叉反应。 建立了检测水牛乳β-乳球蛋白的间接竞争ELISA方法，确定的工作条件如下：包被抗原浓度2.5μg/mL，抗体稀释倍数为1:60000；二抗稀释倍数为1:10000。包被条件为4℃过夜；37℃封阻1h；孵育条件为37℃，1h；加终止液5min后比色。该方法检测的范围为0.1ng/mL～100ng/mL，灵敏度为5.75ng/mL，最低检出限<0.01 ng/mL。用建立的方法对4份样品进行了检测，测得阳光酸酸乳、阳光核桃花生乳、皇氏水牛乳、壮牛水牛乳的β-乳球蛋白含量分别为0.36g/L、0.472g/L、1.097g/L、0．717g/L。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第1章绪论

1.1引言

1.2食物过敏

1.2.1食物过敏的概念

1.2.2食物过敏机理

1.2.3主要过敏性食物

1.3牛乳过敏

1.3.1牛乳中的主要过敏原

1.3.2牛乳中过敏原蛋白的主要结构特征

1.3.3过敏原表位与过敏原性

1.3.4免疫交叉反应

1.4水牛乳业发展概况

1.4.1水牛乳的特点及优势

1.4.2水牛乳业发展概况

1.5食物过敏原的检测

1.5.1食物过敏原的检测方法

1.5.2酶联免疫吸附实验(ELISA)

1.5.3乳过敏原的检测

1.6立题背景与研究内容

1.6.1立题背景

1.6.2研究内容

第2章水牛乳β-乳球蛋白的分离纯化

2.1引言

2.2材料与设备

2.2.1试剂与材料

2.2.2设备

2.2.3溶液的配制

2.3实验方法

2.3.1牛乳的预处理

2.3.2除酪蛋白

2.3.3超滤

2.3.4分离水牛乳β-乳球蛋白

2.3.5检测所分离蛋白的纯度

2.3.6蛋白质含量的测定

2.4结果

2.4.1乳清电泳图

2.4.2离子交换分离水牛乳β-乳球蛋白的结果

2.4.3凝胶层析分离水牛乳β-乳球蛋白的结果

2.4.4蛋白分离过程中样品蛋白含量的变化

2.4.5离子交换层析及凝胶层析分离水牛乳β-乳球蛋白的得率

2.5讨论

2.5.1关于酪蛋白的剔除

2.5.2超滤

2.5.3关于离子交换层析分离水牛乳β-乳球蛋白

2.5.4关于凝胶层析进一步分离纯化水牛乳β-乳球蛋白

2.5.5关于SDS-PAGE、IEF-PAGE检测蛋白的纯度

2.5.6分离过程中蛋白含量的变化

2.6本章小节

第3章抗水牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的制备

3.1引言

3.2材料与设备

3.2.1试剂

3.2.2仪器与耗材

3.2.3溶液配制

3.3方法

3.3.1试验动物

3.3.2抗原的准备

3.3.3免疫方案

3.3.4血清的分离

3.3.5建立检测抗体效价的间接ELISA方法

3.3.6间接ELISA测抗体效价

3.3.7琼脂双向免疫扩散法测抗体效价

3.3.8琼脂双向免疫扩散法检测抗体特异性

3.3.9间接竞争ELISA法检测抗体特异性

3.4实验结果

3.4.1抗血清效价间接ELISA检测方法的建立

3.4.2免疫过程中抗体效价的变化

3.4.3琼脂双向免疫扩散法测抗体效价

3.4.4琼脂双向免疫扩散检测抗体特异性

3.5讨论

3.5.1多克隆抗体的制备

3.5.2抗体效价的检测方法

3.5.3兔对水牛乳β-乳球蛋白的免疫应答

3.5.4抗体特异性

3.6本章小结

第4章水牛乳β-乳球蛋白的间接竞争ELISA检测方法的建立

4.1引言

4.2材料与设备

4.2.1材料与试剂

4.2.2仪器与耗材

4.2.3溶液的配制

4.3方法

4.3.1 ELISA基本操作程序

4.3.2间接ELISA法评价酶标板的质量

4.3.3间接ELISA法确定抗原的最佳包被浓度和抗体的稀释倍数

4.3.4抗原最佳包被条件的确定

4.3.5抗原抗体最佳反应条件的确定

4.3.6最佳封阻条件的确定

4.3.7终止时间确定

4.3.8间接竞争ELISA法比较不同抗体稀释度对竞争抑制曲线的影响

4.3.9间接竞争ELISA法比较不同二抗浓度对竞争抑制曲线的影响

4.3.10间接竞争ELISA标准竞争抑制曲线的制作

4.3.11精确度

4.3.12灵敏度与最低检出限

4.3.13样品检测

4.4结果

4.4.1酶标板质量的评价

4.4.2抗原包被浓度和抗体最佳稀释倍数的确定

4.4.3抗原最佳包被条件

4.4.4封阻条件的确定

4.4.5抗原抗体反应条件的确定

4.4.6终止时间的确定

4.4.7不同抗体浓度对间接竞争ELISA竞争抑制曲线的影响

4.4.8比较不同二抗稀释度对间接竞争ELISA竞争抑制曲线的影响

4.4.9制作间接竞争ELISA标准曲线

4.4.10竞争抑制率批间、批内差异

4.4.11灵敏度与最低检出限

4.4.12样品检测结果

4.5讨论

4.5.1酶标板质量的评价

4.5.2包被

4.5.3封阻

4.5.4抗原抗体反应条件

4.5.5抗体稀释度对竞争抑制曲线的影响

4.5.6酶标二抗稀释倍数对竞争抑制曲线的影响

4.5.7方法的应用与比较

4.6本章小结

第5章结论

致谢

参考文献

硕士期间成果