耐受性树突状细胞体外培养和体内诱导免疫耐受的研究

摘要

目的： 探索耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cell，tDCs)的体外培养方法，观察不同培养条件下tDCs的形态学、细胞表型及功能变化，在小鼠体内建立tDCs诱导特异性免疫耐受方法，为tDCs在预防移植免疫排斥反应和治疗某些自身免疫性疾病的临床应用提供实验依据。 方法： 采用雄性Balb/c小鼠为供体，雌性昆明小鼠为受体。取供体小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞。在含GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子的RPMI 1640培养基中按不同的组合分为五组进行体外诱导培养：空白组(不加任何因子)、常规DC组(GM-CSF+IL-4)、VIP-DC组(GM-CSF+VIP)、DXM-DC组(GM-CSF+DXM)、VIP+DXM-DC组(GM-CSF+VIP+DXM)。光镜下动态观察细胞形态，流式细胞术检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c表达，MTT法检测DC刺激淋巴细胞增殖活性，ELISA法检测DCs培养上清液IL-10、IL-12表达水平。昆明小鼠体内输注实验分四组：空白对照组(不经任何处理)、骨髓细胞组(输骨髓细胞)、常规DC组(输常规培养DCs)、tDCs组(输tDCs)。输注细胞3天后移植供体脾片，移植后20天取移植脾片病理组织学检查，移植后1月流式细胞术检测受体脾单个核细胞CD80、CD86、CD40、CD11c和CD4+CD25+的表达。采用PKH26标记tDCs进行体内定位的研究：输PKH26标记tDCs的受体，1月后取肝、脾、淋巴结、移植脾片等印片或/和冰冻切片，荧光显微镜下观察PKH26标记细胞存在数量。 结果： 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子体外培养能生成具有典型的树枝状突起DCs。常规DC组、VIP-DC组、DXM-DC组、VIP+DXM-Dc组CD11c的表达较高，与空白组比较有显著性差异(P＜0.05)。 2、VIP-DC组、DXM-DC组、VIP+DXM-DC组CD40、CD80和CD86表达，淋巴细胞增殖活性及培养上清液IL-12浓度均低于常规DC组(P＜0.05)，VIP组以浓度为40ng/ml、DXM组以10ng/ml减低明显，其中VIP+DXM-DC组在VIP浓度为40ng/ml、DXM为10ng/ml条件下为最低，差异明显(P＜0.05)。 3、VIP-DC组、DXM-Dc组、VIP+DXM-DC组细胞培养的上清液中IL-10浓度均高于常规DC组(P＜0.05)，VIP组以浓度为40ng/ml，DXM组以10ng/ml升高明显，其中VIP+DXM-DC组在VIP浓度为40ng/ml、DXM为10ng/ml条件下为最高，差异明显(P＜0.05)。 4、小鼠体内tDCs输注实验：tDCs组的移植脾片大体形态呈灰红色，与移植部位周围组织建立血液供应；病理学观察组织结构完整，未见明显变性坏死，与正常脾组织结构相似。而空白对照组、骨髓细胞组、常规DC组移植脾片大体呈灰白色、浅灰红色、灰褐色，与周围组织未建立血液供应；病理学观察组织结构受破坏，有的呈大片坏死。 5、tDCs组小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+双表达细胞为18.15±0.66％，比正常小鼠的6.5±0.55％高近3倍，有显著性差异(P＜0.05)；CD40、CD11c、CD80、CD86的表达比正常小鼠低，有显著性差异(P＜0.05)。 6、PKH126标记tDCs体内实验：输荧光染色tDCs受体小鼠的组织印片，脾脏的荧光细胞数量最多(44±3/HP)、肝脏次之(26±2/HP)、淋巴结较少(3±1/HP)。冰冻切片显示：脾脏的荧光细胞数量最多(43±3/HP)、肝脏次之(24±2/HP)、淋巴结较少(2±1/HP)。 结论: 1、小鼠骨髓单个核细胞，体外经GM-CSF、VIP或/和DXM、LPS联合诱导培养生成致耐受性树突状细胞(tDCs)。 2、与GM-CSF、IL-4和LPS联合常规诱导培养DCs方法比较，tDCs具有CD40、CD80、CD86表达低；刺激淋巴细胞增殖弱；tDCs培养体系上清液IL-10水平高而IL-12水平低。 3、GM-CSF、VIP+DXM、LPS联合诱导培养生成tDCs效果较佳，其中以VIP40ng/ml、DXM10ng/ml的培养条件为最好。 4、在移植脾片小鼠模型，经腹腔注射tDCs能诱导受体对移植器官产生特异性免疫耐受。 5、小鼠体内输注tDCs，其脾脏CD4+CD25+Treg细胞增高，CD11c、CD40、CD80、CD86表达降低。 6、腹腔注射tDCs能迁移至脾、肝脏、淋巴结，其中以脾脏分布最多。 7、腹腔注射tDCs安全性较好，并能形成稳定的嵌合，且维持1月以上。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

第二章耐受性树突状细胞的体外培养、基本特征及功能鉴定

2.1主要仪器与材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1标本来源

2.2.2骨髓单个核细胞的分离

2.2.3细胞的培养

2.2.4细胞实验分组

2.2.5树突状细胞表型分析

2.2.6树突状细胞刺激淋巴细胞增殖活性测定

2.2.7细胞因子检测

2.2.8体内输注实验分组

2.2.9小鼠脾片移植模型的建立

2.2.10移植脾片的病理组织学观察

2.2.11移植脾片小鼠脾单个核细胞表型分析

2.2.12 tDCs的体内定位

2.2.13数据统计学处理

2.3实验结果

2.3.1培养的耐受性树突状细胞的光镜观察

2.3.2不同条件培养组DCs表面标志变化

2.3.3混合淋巴细胞反应

2.3.4不同培养组DCs培养上清中IL-10、IL-12表达水平

2.3.5小鼠脾片移植模型的建立

2.3.6 tDCs的体内定位

2.4讨论

2.4.1 tDCs来源、标志及作用

2.4.2 tDCs的体外培养方法

2.4.3tDCs体内诱导免疫耐受作用

2.4.4 tDCs与调节性T细胞相互作用的影响

2.4.5 tDCs输注途径、数量、时机及安全性

2.4.6tDCs的体内定位

2.5结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表文章

综述 成纤维细胞生长因子与造血调节研究进展