γδTreg诱导免疫耐受性树突状细胞在移植物抗宿主病中的作用及机制研究

摘要

背景:
　　异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液系统疾病的有效手段，急性移植物抗宿主病(aGVHD)成为阻碍移植成功的关键因素之一。目前aGVHD的最主要预防和治疗手段为免疫抑制药物，但容易导致移植后感染风险增加;体内外去除T细胞是另一种常用的策略，但也伴随着植入失败、移植后复发率增高等风险。近年来越来越多的免疫细胞亚群被发现在aGVHD调控中起重要作用，过继免疫细胞输注调控aGVHD具有较好的临床应用前景。
　　调节性γδT细胞(γδTreg)是新发现的γδT细胞亚群，该细胞亚群具有与Foxp3+αβTreg细胞相似的生物学特性，发挥负向免疫调控功能。我们前期建立了高效的γδTreg体外诱导扩增富集体系，并发现该群细胞能负向调控小鼠allo-HSCT后aGVHD但不影响GVL效应，但机制尚未完全明确。通过细胞间接触的方式抑制T细胞的增殖活化是其中的机制之一。进一步阐明γδTreg负向调控aGVHD的完整机制将为其临床应用奠定基础。
　　抗原提呈细胞树突状细胞(DC)在aGVHD发生发展的病理生理过程中起重要作用。DC在预处理后活化，活化后的DC处理并递呈宿主抗原给供者来源的T细胞，并进一步通过共刺激分子信号使得T细胞活化和增殖，这是aGVHD起始阶段的关键事件。近年来通过诱导免疫耐受性DC的生成是aGVHD治疗中重要的研究方向。αβTreg与免疫耐受性DC之间有互相诱导生成的作用，两者共同参与维持移植后的免疫耐受。因此，我们推测γδTreg诱导免疫耐受性DC的生成是其发挥负向调控aGVHD的机制之一。在本研究的前两部分，我们首先在体外研究了γδTreg诱导免疫耐受性DC的生成，包括对DC成熟、吞噬、刺激活化T细胞、黏附、迁移等功能影响，并探讨了可能的机制;进一步在人源化小鼠aGVHD模型体内环境中验证了γδTreg诱导免疫耐受性DC是其发挥负向调控aGVHD作用的机制之一。
　　另一方面，目前关于Foxp3+γδTreg的研究都是采用富集了γδTreg的γδT混合细胞，但这不能完整反映Foxp3+γδTreg的真实生物学功能。目前尚未发现Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT之间具有差异表达的膜蛋白可供分选纯化，这也大大限制了对Foxp3+γδTreg的生物学功能的进一步研究和相应的临床应用。因此，本研究的第三部分通过单细胞转录组测序技术探索了Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT的转录组差异，为寻找两者之间差异表达的膜蛋白从而进一步能纯化分离Foxp3+γδTreg提供新的思路。
　　具体研究内容分为3部分:
　　1)γδTreg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究;2）γδTreg细胞体内诱导免疫耐受性DC的生成发挥负向免疫调控aGVHD的作用;3）γδTreg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化。
　　第一章γδTreg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究
　　目的:
　　研究γδTreg体外诱导免疫耐受性DC生成的作用，包括对DC成熟、吞噬、迁移、黏附、活化T细胞等功能的负向免疫调控作用，并阐明相应的机制。
　　方法:
　　从健康成年人外周血中分离单个核细胞(PBMCs)，分别进行DC和γδTreg的诱导培养。γδTreg与iDC或mDC共培养48h后磁珠分选去除γδTreg，通过流式细胞术检测共刺激分子荧光强度，采用FITC-Dextran的胞吞实验，混合淋巴细胞反应，与内皮细胞的黏附实验，Transwell下趋化因子的迁移实验等检测DC吞噬、黏附、迁移等功能，并在共培养过程中加用Transwell或阻断抗体来进一步阐明γδTreg诱导免疫耐受性DC生成的机制。
　　结果:
　　γδTreg与iDC共培养后能显著抑制LPS促进的iDC成熟，CD80、CD86、CD40、HLA-DR表达水平显著下调，该抑制作用依赖于ICOS/ICOSL的结合，同时还能显著抑制iDC的吞噬功能。γδTreg与mDC共培养后能显著抑制mDC的黏附功能，以及向CXCL12的迁移功能，相应的CXCR4表达下调，而对CCR7无影响，对黏附功能的抑制同样依赖于ICOS/ICOSL的结合。与γδTreg共培养后iDC和mDC刺激活化T细胞的能力均显著降低。
　　结论:
　　γδTreg体外可通过抑制DC成熟、吞噬、迁移、黏附、活化T细胞等功能诱导免疫耐受性DC的作用，γδTreg对DC的负向免疫调控功能部分依赖于ICOS/ICOSL的结合。
　　第二章γδTreg细胞体内诱导免疫耐受性DC的生成发挥负向免疫调控aGVHD的作用
　　目的:
　　在第一章中我们在体外已经明确了γδTreg可诱导免疫耐受性DC的生成，本章通过构建人源化小鼠aGVHD模型验证γδTreg在aGVHD体内环境下对DC的调控作用。
　　方法:
　　采用NOG小鼠辐照后回输PHA活化的hPBMCs与体外培养的iDC构建人源化小鼠aGVHD模型，其中一组同时回输γδTreg细胞，比较两组小鼠的aGVHD症状、生存时间、aGVHD靶器官损伤;移植后第7天检测比较两组小鼠人细胞的嵌合程度，以及脾脏、外周血中DC共刺激分子表达水平、DC的黏附迁移能力。
　　结果:
　　1）小鼠异体移植模型中，aGVHD组的DC共刺激分子水平显著高于无aGVHD组;
　　2）γδTreg对人源化小鼠aGVHD模型具有保护作用，小鼠aGVHD症状减轻，生存时间延长，靶器官损伤小;
　　3）γδTreg对小鼠aGVHD体内环境中外周血、脾脏的人DC免疫调控功能不同。γδTreg显著下调外周血人DC的共刺激分子表达水平，但对脾脏中人DC的共刺激分子抑制作用不明显;相反，γδTreg能显著抑制脾脏中人DC的迁移黏附功能，但对外周血中人DC的黏附迁移功能无显著影响。
　　结论:
　　γδTreg对人源化小鼠aGVHD模型具有保护作用。γδTreg在aGVHD体内环境下可诱导免疫耐受性DC的生成，但对外周血和脾脏DC的调控功能不同。γδTreg诱导免疫耐受性DC是其发挥负向调控aGVHD作用的机制之一。
　　第三章γδTreg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化
　　目的:
　　探索比较Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT之间的转录组差异，筛选Foxp3+γδTreg表面特异性分子标记。
　　方法:
　　采用流式细胞术检测常见的可能分子标记在Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT两群细胞中的表达;采用单细胞转录组测序在单细胞水平比较Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT的转录组差异，多种策略对比筛选出在两群细胞间差异表达基因，并通过蛋白定位数据库筛选出其中定位于膜的蛋白基因，进一步通过高通量单细胞qPCR验证筛选。
　　结果:
　　常见的可能分子标记CD127、CD45RA、 CD49d、 CTLA-4、GITR、ICOS、CD27、CD69在Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT两群细胞中均未见显著差异表达，不能用于Foxp3+γδTreg的纯化分选;Foxp3在诱导培养体系中是不稳定表达的，诱导培养早期迅速增高，高峰期维持约15天，40天左右小于5％，但Foxp3+比例小于5％时细胞状态差，难以用于转录组测序比较分析;单细胞水平Foxp3mRNA转录水平呈现连续分布，单细胞转录组测序对比筛选出278差异表达基因，通过蛋白定位数据库筛出膜蛋白差异表达基因35个，进一步通过高通量单细胞qPCR验证筛选出8个可能在两群细胞间差异表达的分子标记。
　　结论:
　　我们首次通过单细胞转录组测序在单细胞水平揭示了Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT细胞的转录组差异，并通过筛选验证获得了8个潜在的Foxp3+γδTreg特异性分子标记。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

绪论

1 第一章 γδTreg体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究

1．1 引言

1．2 实验试剂与仪器

1．3 实验方法

1．4 实验结果

1．5 讨论

2 第二章 γδTreg细胞体内诱导免疫耐受性DC的生成发挥负向免疫调控aGVHD的作用

2．1 引言

2．2 实验试剂、仪器与实验动物

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

3 第三章 γδTreg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

4 总结

参考文献

综述 树突状细胞在急性移植物抗宿主病中的作用

作者简历及在读期间取得的科研成果和奖励