可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1(sFlt-1)对动脉粥样硬化斑块的作用

摘要

目的：构建携带可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1（sFlt-1）目的基因的重组真核表达载体，将sFlt-1重组质粒转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），观察目的基因在内皮细胞中的表达，并将sFlt-1重组质粒导入动脉粥样硬化斑块内，观察局部高表达的sFlt-1对动脉粥样硬化斑块的作用。 方法：1.携带sFlt-1cDNA的重组基因载体的构建：从含有目的基因的质粒克隆模板中，利用酶切的方法获得目的基因，酶切目的载体，纯化酶切产物后进行定向连接，转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。2.HUVEC的培养以及western blotting检测sFlt-1基因在HUVEC中的表达：pEGFP-N1-sFlt-1重组质粒转染体外培养的HUVEC，通过荧光及western blotting检测sFlt-1基因在体外培养的内皮细胞的表达。3.sFlt-1基因对动脉粥样硬化斑块的影响：雄性新西兰大白兔48只，随机分为4组。①正常对照组（n=8）。②假手术组（n=8）。③球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1组（n=16）。④球囊损伤+高脂饮食+pEGFP-N1-sFlt-1组（n=16）。一、二两组给予正常颗粒饲料饮食，三、四两组给予高脂饮食，两周后第二组行假手术，三、四两组均行髂动脉球囊损伤血管内皮，其中第三组在球囊损伤后导入空质粒pEGFP-N1，第四组球囊损伤后导入目的基因sFlt-1，3天后western blotting检测局部sFlt-1基因的表达。实验开始及实验结束时分别检测高脂血症的形成情况。3个月后取靶血管行HE染色对斑块进行形态学测量，CD34免疫组化阳性细胞数检测观察新生血管形成情况。 结果：1.成功构建携带sFlt-1基因的重组质粒pEGFP-N1-sFlt-1，2.sFlt-1基因转染HUVEC后有效表达，3.成功制备兔髂动脉粥样硬化斑块模型，4.sFlt-1基因有效抑制动脉粥样硬化斑块的发生、延缓斑块的发展。 结论：局部高表达的sFlt-1基因抑制兔髂动脉粥样硬化斑块的发生与发展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词

声明

第1章引言

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1 pEGFP-N1-sFlt-1重组质粒的构建

2.2.2人脐静脉内皮细胞(HVEC)的培养以及western blotting检测sFlt-1基因在内皮细胞中的表达

2.2.3动脉粥样硬化动物模型的建立以及sFlt-1基因对动脉粥样硬化斑块的影响

2.3数据统计与处理

第3章结果

3.1 pEGFP-N1-sFlt-1质粒的构建和鉴定

3.1.1目的基因片段酶切产物凝胶电泳

3.1.2真核表达载体酶切后琼脂糖凝胶电泳

3.1.3阳性克隆的PCR鉴定

3.1.4阳性克隆的测序鉴定

3.2人脐静脉内皮细胞(HVEC)的培养以及western blotting检测sFlt-1基因在内皮细胞中的表达

3.2.1 转染人脐静脉内皮细胞后绿色荧光蛋白的表达

3.2.2 Western blotting检测目的基因在内皮细胞中的表达

3.3兔动脉粥样硬化斑块模型的建立及sFlt-1基因的表达对动脉粥样硬化斑块的影响

3.3.1 Western blotting检测目的基因在髂动脉血管壁的表达

3.3.2血脂的测量

3.3.3斑块形态学测量及斑块内CD34阳性细胞数计数

第4章讨论

4.1 pEGFP-N1-sFlt-1重组质粒的构建

4.2人脐静脉内皮细胞(HVEC)的培养以及western blotting检测sFlt-1基因在内皮细胞中的表达

4.3动脉粥样硬化动物模型的建立以及sFlt-1基因对动脉粥样硬化斑块的影响

第5章结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

附图

综述：新生血管形成与动脉粥样硬化

攻读学位期间的研究成果