芦笋性别决定基因分子标记的筛选与开发

摘要

芦笋(Asparagus officinalis L.)是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜,具有“蔬菜之王”的美誉。芦笋雌雄异株,性别是由位于同型性染色体L5上的一对等位基因(M-m)控制,雄性M-,雌性mm。其雄株因不结种子消耗养分少,产量比同期生长条件的雌株高出25％以上,且寿命长,抗性强,为此全球正在大力开展芦笋全雄育种。芦笋超雄株(MM)与雌株杂交后代全部为雄株(Mm)(MM×mm→Mm),此过程称之为全雄育种,超雄株的筛选是芦笋全雄育种的关键。然而,超雄株与普通雄株即使在开花期表型上也没有任何差异,且芦笋从播种到开花大约需要2年时间,若利用与芦笋性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记辅助选择,苗期快速准确筛选出超雄株,可加快芦笋全雄育种进程,提高育种效率。本研究利用简单重复序列区间多态性(ISSR)、序列相关扩增多态性(SRAP)等DNA分子标记技术结合群体分离分析方法(BSA)对芦笋性别决定基因连锁的DNA.分子标记进行筛选、转化研究,这些标记的获得与转化将有助于芦笋性别(包括超雄株)早期快速鉴别和性别决定基因的定位研究。主要研究结果如下:
　　 1.首先进行了芦笋基因组DNA的改良CTAB法、SDS法和试剂盒提取方法的比较研究。结果表明:以芦笋嫩绿的拟叶为试验材料,经改良CTAB法提取的DNA完整性好、浓度和纯度都比较高,综合效果优；加入2％PVP和0.1％的巯基乙醇可以去除多糖、多酚类物质和防止褐化现象的发生；在芦笋两性现象调查的基础上,利用两性株自交雌雄分离群体S1代,通过群体分离分析法(BSA),构建4对B23(Thielim),B24(Grolim),B25(Backlim),B33(Guelph Millenium)雌雄分离后代的DNA池和1770(MM)以及杂交后代品种G190-1(mm),总共5对DNA池进行性别连锁标记的筛选研究；
　　 2.利用单因素分析方法优化了芦笋基因组的ISSR反应条件,得出较优的ISSR反应条件是:25μL反应体系中,基因组DNA50ng,引物5μmol/L2μL,dNTP200μmol/L2μL,10×buffer2.5μL,Mg2+25mmol/L2.5μL,Taq酶1U；反应程序是94℃预变性5min；32个循环中变性94℃1min,48℃～53℃复性1min,72℃延伸1min；最后72℃延伸10min:
　　 3.利用构建好的5个品种内的雌雄DNA池作为材料进行ISSR分析,筛选和检测到ISSR3引物在所有5对雌雄DNA池间具有多态性,获得2条多态性片段,克隆测序；结果表明:Asp_1全长为778bp,编码4个ORF；Asp_2全长是993bp,编码6个ORF。经Blastn比对,没有发现同源相关序列,是新开发的芦笋基因组序列；
　　 4.单株验证发现Asp1和Asp2与性别决定基因连锁,根据Asp1测序结果设计了2对特异性引物,将Asp1转化为更稳定的标记SCAR15'-ATTGCGAGCATTGTAATCTTCTTC-3’,R:5'-TTGTCATTGGATAGGGAGT-3’),SCAR2(F:5'-TCATTGGATAGGGTTGGAGTCGG-3’,R:5'-TGTG-CATTTCATCACCTCGGTCT-3’),SCAR1能够在芦笋基因组上稳定扩增,与芦笋性别决定基因连锁,并表现为共显性,共显性标记SCAR1的获得将有助于芦笋超雄株(MM)的快捷筛选,经初步雌雄分离单株验证得出准确率是83％；而SCAR2在雌雄群体中都能扩增出来,可作为芦笋特异性标记；根据Asp_2测序结果设计了1对特异性引物,将Asp_2转化为更稳定的标记SCAR3(F:5'-TACCCCGTATCTTCTGGTGAGTG-3’;R:5'-CGAGTTTTGTGATTCTTTGTGGC-3’),通过在5对DNA池和12株雌雄单株中验证,SCAR3在雄株DNA中稳定扩增,与芦笋性别决定基因连锁,经初步雌雄分离单株验证得出准确率是90％。
　　 5.建立了芦笋基因组DNA的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer;扩增程序为:94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃30s、35℃30s、72℃1.5min的条件下运行；随后的35个循环退火温度提高到50℃；最后72℃延伸10min。得出6％变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物效果比琼脂糖检测分辨率高,适合进行SRAP扩增差异片段分析；
　　 6.利用该优化体系进行了256对SRAP引物筛选,从中筛选出扩增条带清晰丰富、重复性好的引物组合239个,占整个引物序列的93.36％;回收了引物组合ME3+EM12在品种B23雌雄DNA池内200～500bp间具有多态性的扩增差异条带Asp-3,测序得出序列长度为307bp,经Blastn分析为芦笋新的基因组序列,并将 ME3+EM12引物对转化成了 SCAR4(F:5'-CCTGTTCCGTTTACTTAGGACAATC-3’,R:5'-GGGTATTATTTGGAGAAGGTGGAG-3’)。SCAR4在各品种的雌雄株之间稳定扩增,但没有多态性。