甲型流感病毒核蛋白基因真核质粒构建及表达

摘要

流感病毒是严重危害人类的呼吸道传染病原体,曾多次引起世界流感大流行。它是单链负链RNA病毒,其基因由8段RNA组成编码11种蛋白:血凝素HA,神经氨酸酶NA,基质蛋白M1,离子通道蛋白M2,非结构蛋白NS1和NS2,核蛋白(nucleoprotein,NP),凋亡前体蛋白PB1-F2和RNA依赖性RNA聚合酶PA,PB1和PB2等。核蛋白NP为流感病毒颗粒的重要组成部分,由498个氨基酸组成分子质量约56 KD的多肽,是甲型流感病毒RNA的第5节段基因编码的RNA结合蛋白,与多聚酶蛋白及病毒单链的RNA相互作用形成螺旋对称的RNP复合体。RNP复合体,与依赖RNA的多聚酶一起成为病毒基因组复制与转录必不可少的结构。NP也是细胞毒性T淋巴细胞识别的主要抗原。所以甲型流感病毒核蛋白基因可以作为防治流感病毒的一个主要靶点.
　　 目的:
　　 本实验通过构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表达质粒,转染Hela细胞,并检测Hela细胞内NP的表达情况,为进一步研究核蛋白的功能和相关理化作用及对核蛋白的影响奠定基础。
　　 方法：
　　 根据NCBI数据库已发表的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)毒株的核蛋白基因全长序列用Primer Primier5软件设计两条NP的特异引物并加酶切点,用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,酶切后,将其插入到真核表达质粒pcDNA3.1(+)。构建好的重组质粒pcDNA3.1(+)/N P经酶切、PCR、测序鉴定。将构建好的pcDNA3.1(+)/N P用脂质体转染法转染Hela细胞,用甲型流感病毒检测试剂盒(Flu A Rapid Test Kit)检测检测Hela细胞内外NP的表达情况。
　　 结果：
　　 经PCR克隆出的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因,经酶切连接后构建一个新的重组质粒pcDNA3.1(+)/N P,该质粒经酶切、PCR、测序鉴定均表明成功构建了pcDNA3.1(+)/N P。构建的质粒含一个核苷酸长度为1432bp的基因,和A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)有98％的同源性。
　　 重组质粒转染Hela细胞后用甲型流感病毒检测试剂盒检测到24h、48h、72h细胞内外NP的蛋白表达。
　　 结论：
　　 成功构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/N P。并且通过试剂盒检测能在Hela细胞中表达。为进一步研究理化因素对该基因的影响和该基因的结构和功能打下基础。