人膜联蛋白A10基因过表达慢病毒的构建及其对人肝癌细胞株HepG2体外效应的研究

摘要

目的：⑴构建人膜联蛋白A10基因(annexinA10，human，ANXA10)和增强绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescence protein，EGFP)融合基因的重组慢病毒；⑵通过检测重组慢病毒对人肝癌细胞株HepG2凋亡、增殖的影响及其对HepG2细胞中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。初步阐明膜联蛋白A10基因在人肝癌增殖、凋亡及转移中的作用。
　　 方法：①针对已经筛选确定的ANXA10基因并将基因克隆转入到慢病毒载体表达质粒PGC-Fu[增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中，通过酶切、测序验证ANXA10基因后，将PGC-Fu-ANXA10质粒和包装质粒pHdper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞，获得携带ANXA10基因和GFP基因的重组慢病毒PGC-Fu-ANXA10。②体外实验中，将上述慢病毒以最适MOI转染人肝癌细胞株HepG2，分成ANXA10-慢病毒组、慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组。荧光显微镜观察GFP表达以确定转染效率，采用RT-PCR在mRNA水平检测ANXA10基因表达的变化，采用Western blotting在蛋白质水平检测ANXA10基因表达的变化，以明确ANXA10对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用，通过流式细胞技术及MTT法测定其对人肝癌细胞株HepG2凋亡及增殖情况，并运用同样的方法分别从mRNA和/或蛋白质水平检测MMP9、VEGF表达的变化。
　　 结果：⑴成功构建人ANXA10基因过表达慢病毒，测序验证序列正确，经包装产生的病毒滴度为2E+8。⑵人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2，在转染后3-4d GFP接近高峰，转染率达70％。MOI值=10是最适的MOI值，加polybrene使其终浓度为5μg/ml，转染效果更佳。⑶人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG272h后的增殖情况分析，ANXA10-慢病毒组于转染72h后HepG2细胞的体外增殖抑制率达24.646％，与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而慢病毒空载组HepG2细胞生长抑制率与HepG2细胞未转染组比较无明显差异(P>0.05)；凋亡实验显示，ANXA10-慢病毒组细胞凋亡率为51.92±1.41％，慢病毒空载组细胞凋亡率为19.00±1.12％，HepG2细胞未转染组细胞凋亡率为3.59±0.89％，ANXA10-慢病毒组明显高于慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组(P<0.05)。⑷转染HepG2细胞后，采用半定量RT-PCR技术及Western blotting技术检测结果显示，与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较，ANXA10-慢病毒组中ANXA10 mRNA及ANXA10蛋白表达明显升高(P<0.05)。⑸人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2后，显示ANXA10-慢病毒组MMP-9、VEGF mRNA和蛋白的表达量较慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组相比均明显下降(P<0.05)。
　　 结论：①人ANXA10基因过表达抑制人肝癌细胞株HepG2增殖并促进其凋亡。②人ANXA10基因过表达能下调HepG2中肝癌侵袭转移相关的细胞因子MMP-9、VEGF的表达，并可能由此进一步抑制肝癌的侵袭转移。