胰腺癌细胞系AsPC-1中miR-148a/b靶基因DNMT1的鉴定

摘要

目的：
　　 通过双荧光蛋白报告基因分析系统，在胰腺癌细胞系AsPC-1中鉴定miR-148a/b的靶基因为DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)，以期对miR-148a/b在胰腺癌中的作用功能及胰腺癌发病机制的深入研究提供基础理论支持。
　　 方法：
　　 1.结合生物信息学技术并采用多种靶基因预测软件预测miR-148a/b靶基因DNMT1。
　　 2.以人全血中提取的基因为模板，PCR扩增pri-miR-148a/b序列，全长为225bp、279bp，产物克隆至pcDNA3.1(+)载体上，通过酶切、测序验证后获得pcDNA3.1/pri-miR-148a，pcDNA3.1/pri-miR-148b基因。
　　 3.以Hela细胞RNA的RT产物为模板，通过PCR扩增克隆得到全长为268bp的DNMT1，mRNA3’-UTR区，与表达绿色荧光蛋白(Green fluorescenceprotein，GFP)融合基因的pcDNA3/EGFP质粒连接，通过测序鉴定后，获得pcDNA3/EGFP/DNMT1表达载体。
　　 4.将pcDNA3.1/pri-miR-148a(A组)、pcDNA3.1/pri-miR-148b(B组)分别与pcDNA3/EGFP/DNMT1共同转染于胰腺癌AsPC-1细胞，并加入红色荧光表达质粒pDsRed-C10.1ug作为内参，同时设立C组(只转染pcDNA3/EGFP/DNMT1)及D组(共转pcDNA3/EGFP/DNMT1+pcDNA3.1(+))作为对照。每组设立三个复孔，且实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为实验结果。转染后通过荧光显微镜观察荧光表达量鉴定DNMT1转染率；通过实时定量荧光PCR鉴定pri-miR-148a，pri-miR-148b转染率。48h后在荧光显微镜下观察各组荧光蛋白的表达情况，并用荧光分光光度计测定荧光值。
　　 结果：
　　 1.成功构建表达载体pcDNA3.1/pri-miR-148a、pcDNA3.1/pri-miR-148b、pcDNA3/EGFP/DNMT1，测序验证序列正确。
　　 2.转染48h后，实时定量荧光PCR检测miR-148a表达量，A组相对表达量明显高于对照的D组(6.7569±0.3495:1.0047±0.5396，P<0.05)：检测miR-148b表达量，B组表达量亦明显高于D组(3.2810±0.0802:1.0167±0.349，P<0.05)。证明miR-148a/b通过pcDNA3.1(+)载体转入细胞成功表达。
　　 3.转染48h后，在荧光显微镜下观察，A、B组荧光蛋白表达水平明显低于C组和D组。测定荧光值显示，A组荧光表达量为1.1814±0.0733，B组为1.3501±0.0669均明显低于C组1.9025±0.0507，D组1.9472±0.0445，证明A组及B组荧光蛋白表达水平较C、D组低，结果有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：
　　 通过双荧光蛋白报告基因分析系统，证实在胰腺癌细胞系AsPC-1中miR-148a/b与DNMT1，mRNA3’-UTR区能够互补结合，初步证明DNMT1为miR-148a/b的靶基因。