泰和乌骨鸡活性肽抗氧化与降血压及其补血作用研究

摘要

泰和乌骨鸡(Gallus gallus domesticus brisson)是江西省重要的特色药食资源,既是一种营养丰富的滋补食品,又是特有药用鸡种,被历代医家沿用,历史悠久,名扬中外。大量医药专著和文献记载,乌骨鸡具有补肝肾、益血气、退虚热、调经止带等功能,还可医治心腹痛、虚损、崩中带下、遗精、消渴、久痢、骨折、腰酸腿痛、各种出血症、紫癜、肝炎等疾病。因此,以泰和乌骨鸡为原料生产的生物活性肽具有重要的研究价值。鉴于此,本论文以泰和乌骨鸡活性肽为研究对象,综合运用食品科学、现代分离技术、天然产物化学、现代仪器分析、细胞和动物实验等的一系列技术手段和研究方法,对其抗氧化活性、降血压活性以及补血活性进行了较为全面和深入的研究,主要研究内容与结果如下:
　　 1、采用均匀设计优化的木瓜蛋白酶酶解法制备泰和乌骨鸡活性肽。该活性肽具有较强的O2·一、·OH、DPPH·、ABTS·+清除能力和还原能力,以及良好的Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂质过氧化能力。利用制备型RP-HPLC结合水作流动相,将泰和乌骨鸡活性肽分离成四个组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),组分Ⅱ具有最强的O2·-、DPPH·清除能力和还原能力,以及较强的ABTS·+清除能力,其DPPH·、ABTS·+清除能力和还原能力强于相同浓度下的肌肽；组分Ⅰ具有最强的·OH清除能力。泰和乌骨鸡活性肽富含Glu、Asp、Gly、Ala以及Leu等氨基酸,以及分子量在291-6070Da的小分子肽,这些因素是泰和乌骨鸡活性肽具有较强的抗氧化活性的重要原因。
　　 2、利用超滤分离得到<6kDa的泰和乌骨鸡活性肽。该活性肽具有强烈的O2·-、ABTS·+清除能力和还原能力,以及良好的·OH、DPPH·清除能力、Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂质过氧化能力。确定了0.01M磷酸盐溶液(pH6.8)作为流动相的最佳分离条件,利用制备型RP-HPLC分离<6kDa的泰和乌骨鸡活性肽,得到13个组分,对其采用强酸型离子交换树脂结合强碱型离子交换树脂进行脱盐处理,得到较好的效果。抗氧化活性测定表明,组分4具有强烈的还原能力；组分7具有最强的脂质过氧化抑制活性；组分8具有强烈O2·-、ABTS·+清除活性和还原能力；组分13具有最强DPPH·清除活性。采用RP-HPLC结合水-乙腈作流动相,梯度洗脱分离组分4、8,分别得到4个亚组分。抗氧化活性测定表明,组分4-3具有最强的还原能力；组分8-3具有最强的O2·-、ABTS·+清除能力和还原能力,且强于相同浓度下的肌肽。组分8-3纯度较高,HPLC-ESI+-MS／MS鉴定出其序列为Glu-Pro—Asp-Arg-Tyr。
　　 3、从猪肺中提取ACE,其酶活力为27U／mL。建立RP-HPLC结合水(0.1％甲酸)-乙腈法,测定了泰和乌骨鸡活性肽的ACE抑制活性。采用体外模拟胃肠道消化法对泰和乌骨鸡肉进行酶解,随着消化时间的增加,不同阶段消化液水解度增大,小分子肽含量增加,ACE抑制活性保持在57.8％以上。首先采用超滤分离360min肠道消化液,得到<3kDa泰和乌骨鸡活性肽,其ACE抑制IC50为0.56mg／mL；其次采用制备型RP-HPLC分离<3kDa活性肽,得到3个分离组分,组分F2的ACE抑制活性最强,IC50为0.21mg／mL；最后采用凝胶柱色谱分离F2得到2个分离组分,组分F2-2的ACE抑制活性最强,IC50为0.04mg／mL。利用HPLC／Q-TOF MS从F2-2中鉴定出一种新型的ACE抑制肽,其序列为Glu-Pro-Leu-Tyr-Tyr。
　　 4、采用细胞和动物实验对泰和乌骨鸡活性肽及其分离组分的补血活性进行评价。泰和乌骨鸡活性肽具有促进正常小鼠骨髓有核细胞增殖的作用,其分离组分7、8、9、10可极显著(P<0.01)促进小鼠骨髓有核细胞增殖,浓度为0.1μg／mL时,增殖率可达130％以上。采用RP-HPLC结合DNFB柱前衍生法测得组分7、8、9、10的氨基酸组成,它们主要含有Tyr、Gly、Glu、Asp以及Ala等氨基酸,可推测该5种氨基酸为刺激小鼠骨髓有核细胞增殖活性成分的物质基础。泰和乌骨鸡活性肽可升高失血性血虚小鼠的胸腺和脾脏指数,增强血虚小鼠免疫功能,促进机体快速造血。该活性肽还可显著升高失血性血虚小鼠RBC值(P<0.05):可使5-氟尿嘧啶致血虚小鼠RBC、HOB、HCT值快速恢复到正常水平；可显著升高失血、5-氟尿嘧啶共同致血虚小鼠RBC值(P<0.05),使HGB值快速恢复到正常水平。泰和乌骨鸡活性肽组分8可使失血、5-氟尿嘧啶共同致血虚小鼠HGB值快速恢复到正常水平,并能快速升高血虚小鼠RBC、HCT值。动物实验结果明确表明泰和乌骨鸡活性肽及其分离组分具有一定的补血作用。