重组花生过敏原Arah3壳聚糖纳米粒的制备及其抗过敏作用

摘要

花生过敏是一个引起人们高度关注的食品安全问题,花生过敏多见于速发型过敏反应,有较高的患病率,并且危害患者的生命。迄今为止,国外学者在花生过敏的治疗方面做了许多相关的研究,却没有发现很好的治疗手段,最佳的方法就是避免摄入花生相关的食品。
　　 本研究根据壳聚糖具有组织相容性好、毒副作用小,对人体无危害等优良性质,结合壳聚糖纳米粒的缓释以及不易被消化等特性,制备重组Arah2壳聚糖纳米粒,研究该纳米粒在花生过敏小鼠中的作用。
　　 本论文工作包括花生过敏原Ara h2的原核表达及纯化、重组Ara h2壳聚糖纳米粒的的制备、花生过敏小鼠模型的构建及重组Ara h2壳聚糖纳米粒抗过敏作用的实验动物学研究。主要研究工作结果及结论如下。
　　 1人工合成Arah2基因,利用基因工程技术成功地构建了pET-32a-Arah2表达载体,并将其转入E.coli origami宿主菌中,酶切分析显示构建正确。经DNA测序分析表明插入片段位置、方向、大小序列均正确。用IPTG进行诱导,通过不连续SDS-PAGE电泳分析,获得了分子量约为35kD的表达蛋白,与理论值相符。菌体经过超声粉碎,分离超声后的上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白为部分可溶性。用Ni2+亲和层析柱纯化含有His标签的重组Arah2蛋白,纯化得到了重组Arah2蛋白。
　　 2采用离子交联法制备重组Arah2壳聚糖纳米粒,重组Arah2被壳聚糖包裹后,通过BCA法检测蛋白浓度并计算重组Ara h2壳聚糖纳米粒的包封率和载药率。SDS-PAGE电泳检测表明,Ara h2被成功地包裹在壳聚糖中,扫描电镜(SEM)鉴定该纳米粒粒径为230nm～670nm,进一步用花生过敏病人血清作为一抗进行Western-Blotting分析,结果发现重组Ara h2壳聚糖纳米粒能与血清特异性IgE结合,表明已成功制备了具有免疫原活性的重组Arah2壳聚糖纳米粒。
　　 3将用丙酮脱脂法提取的花生粗蛋白通过皮下注射C578L／C小鼠致敏,同时设立阴性对照(Naive)组,然后再用重组Ara h2壳聚糖纳米粒经灌胃给药治疗致敏小鼠,并分别设立重组Ara h2和壳聚糖纳米粒对照组。处死小鼠,用ELISA法检测血清特异性IgE、IgG2a、血浆组胺水平及脾细胞分泌IL-4、IL5、IL13、IFN-r的水平。与其它组相比,经过重组Ara h2壳聚糖纳米粒治疗后,明显降低血清特异性IgE及血浆组胺水平,上调特异性IgG2a水平,同时使脾细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13的水平下降,而IFN-r的分泌量增加。研究结果表明,以壳聚糖为佐剂的重组Ara h2纳米粒进行免疫治疗,能够逆转Th1／Th2反应平衡,产生以Th1为主的免疫应答。因此,重组Ara h2壳聚糖纳米粒具有抗花生过敏的显著功效。