花生、河虾过敏原抗体的制备及压电免疫传感同步检测

摘要

花生、河虾属于八大类容易引起过敏的食品，相对其它食品过敏而言，它们的过敏发生率较高、临床症状更为严重，在公共卫生和食品安全领域倍受人们的关注。而现有的过敏原检测方法操作繁琐，无法满足快速、简便、在线检测的要求，因此，研究和建立一种方便、安全和快速的检测方法具有重要意义。
　　 研究主要内容包括花生、河虾过敏原的分离纯化，免抗花生、河虾多克隆抗体的制备，探索胶体金是否可以作为一种新型的免疫佐剂；运用自组装的压电免疫传感器测定花生抗体和河虾抗体的免疫亲和常数，并同时包被两种抗体，对过敏原分别进行筛检。
　　 花生、河虾蛋白浸液经硫酸铵分级沉淀，等电点沉淀，AKTA蛋白纯化系统得到纯化，收集后经电泳检验。采用柠檬酸三钠还原法制备得到16nm左右的胶体金，以新西兰大白兔为模式动物制备抗体，免疫过程设立胶体金为佐剂和弗氏完全(不完全)佐剂作对照，发现胶体金能够显著提高大白兔体内抗花生、河虾过敏蛋白的抗体水平，花生与胶体金组的平均效价比弗氏佐剂组提高了一倍，其IC50为34.28 ng/mL；河虾与胶体金组的平均效价比弗氏佐剂组提高了25%，其IC50为43.95 ng/mL。
　　 运用自组装的压电免疫传感器测定得到花生抗体的亲和常数Kα=2.86×107L/mol，混合抗体对花生抗原的Kα=1.37×107 L/mol；河虾抗体的Kα=5.16×107L/mol，混合抗体对河虾抗原的Kα=2.57×107 L/mol。自组装的压电传感器同时包被花生和河虾混合抗体，分别加入一系列浓度的花生过敏原及河虾过敏原进行检测，绘制得到各自的标准曲线和其检测灵敏度。同时进行加标回收实验，回收率较高，重现性较好，实现了花生、河虾过敏原的同步筛检。
　　 本研究所建立的自组装的压电传感器同时包被花生、河虾两种抗体，实现了同步对花生、河虾过敏原的检测，快速、方便，具有较好的实用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

1. 引言

1.1 食品过敏原

1.1.1 食品过敏的定义

1.1.2 食品过敏原的种类

1.1.3 食品过敏原的机理

1.2 食品过敏原的检测技术

1.3 胶体金的免疫分析

1.3.1 胶体金的性质

1.3.2 胶体金的应用

1.4 压电免疫传感器检测技术

1.4.1 压电免疫传感器的结构

1.4.2 理论基础

1.4.3 压电免疫传感器的应用

1.5 本课题的意义及主要研究内容

1.5.1 研究意义

1.5.2 研究内容

2. 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料和试剂

2.1.2 主要溶液

2.1.3 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 花生、河虾过敏蛋白的制备

2.2.2 抗体的制备

2.2.3 抗体的纯化

2.2.4 纯化后抗体的含量

2.2.5 间接ELISA测定抗体效价

2.2.6 最佳包被抗原浓度及抗体稀释度的筛选

2.2.7 竞争ELISA标准曲线的制作以及半数抑制浓度IC50的确定

2.2.8 特异性测定

2.2.9 自组装压电传感器抗体包被浓度的确定

2.2.10 自组装的压电免疫传感器测亲和常数

2.2.11 花生、河虾抗原的同步检测

3. 结果与讨论

3.1 目的蛋白的分离纯化

3.2 SDS-PAGE鉴定

3.3 纯化后抗体含量的测定结果

3.4 胶体金制备结果

3.5 胶体金与花生、河虾抗原结合最佳稳定量

3.6 间接ELISA测定抗体效价及最佳包被抗原浓度和抗体稀释度

3.7 竞争ELISA标准曲线的制作以及半数抑制浓度IC50的确定

3.8 特异性的测定

3.9 自组装压电传感器抗体包被浓度的选择

3.10 绘制标准曲线

3.11 抗体亲和常数的测定

3.12 花生、河虾过敏原的同步筛检

3.12.1 标准曲线的制作

3.12.2 最低检测限

3.12.3 回收实验

3.12.4 重现性

4. 主要结论

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文