双歧杆菌黏附蛋白的筛选、克隆表达及其功能的初步研究

摘要

双歧杆菌在调节肠道微生态平衡、抑制病原微生物的侵入、抗肿瘤、抗突变和抗衰老等方面具有重要的作用。双歧杆菌对肠黏膜上皮细胞的黏附和定植是其发挥生理作用的前提,也是评价其作为微生态活菌制剂的一个重要指标。
　　 本文主要探究了黏附蛋白BIF在双歧杆菌属中的分布,探求了长双歧杆菌未知功能的黏附蛋白的存在。即:1、通过分子克隆表达技术获得了长双歧杆菌黏附蛋白BIF,并从四株双歧杆菌中获得了类BIF蛋白的基因和蛋白；2、以磁性纳米材料为载体,直接筛选获得了黏附肠上皮细胞的长双歧杆菌的表面蛋白；3、对上述蛋白体外黏附肠上皮细胞的生物学功能进行了初步研究。
　　 有关论文的详细内容分述如下。
　　 益生菌和致病菌的黏附是影响宿主健康的重要步骤。本文综述了近年来益生菌及致病菌对肠道上皮细胞黏附机制的研究进展,比较了其黏附后的生物学效应差异,重点对两者之间的竞争性黏附作用进行了概述。在上述基础上对益生菌抑制致病菌的研究前景和发展趋势进行了展望。
　　 双歧杆菌的黏附蛋白BIF在益生菌中的分布及功能差异鲜有报道,为此本文开展了较为详细的研究。首先,本文以长双歧杆菌的BIF为研究对象,成功构建了pBIF-GEX重组表达质粒,经转化大肠杆菌DH5α后诱导表达,GST亲和柱纯化,获得了高纯度的BIF蛋白。量子点标记BIF蛋白证实了其与肠上皮细胞HT-29的黏附。平板计数法验证了BIF对单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7黏附HT-29具有明显的抑制作用,而对长双歧杆菌和植物乳杆菌的黏附没有显著影响。50μg／mL的BIF能使单核增生李斯特菌的黏附率从41.6％降到8.6％,大肠杆菌O157.H7从44.3％降到10.4％:BIF浓度对HT-29细胞的细胞因子IL-4、IL-8的产生呈正相关,而对TNF-α无显著影响。
　　 为从益生菌中获得BIF或类BIF的基因和蛋白,本文制备了抗BIF蛋白的鼠源多克隆抗体,通过斑点杂交法筛选,证实了婴儿双歧WBIN03,婴儿双歧WBAN07,青春双歧WBAD08,乳双歧WLAB09存在BIF蛋白。以bif-F1、bif-R1为引物,验证了上述4株双歧杆菌中bif基因的存在,bif类似基因与bif基因的同源率分别达到89.71％、82.53％、90.75％和82.91％。类似地,克隆表达的这四种BIF蛋白中有三种BIF类似蛋白被证实对肠上皮细胞有黏附功能。
　　 探求未知功能的双歧杆菌黏附蛋白是一项具有挑战性的研究。为此,本文采用了磁珠偶联肠上皮细胞碎片,与长双歧杆菌膜蛋白相互作用的策略,分离了4种黏附相关蛋白。经质谱测序、生物信息学分析,获得了完整的蛋白序列和基因序列。同样,经克隆表达、量子点标记,发现这四种蛋白中的三种对HT-29细胞有黏附功能。其中PP1对HT-29细胞因子IL-4、IL-8、TNF-α的产生有显著影响。
　　 综上所述,探究益生菌的黏附蛋白和相关基因,在细胞水平上研究益生菌对致病菌的黏附拮抗以及对肠上皮细胞产细胞因子的影响,对提高我国在益生菌研究领域的分子研究水平,为功能基因和功能蛋白在微生态学领域的应用奠定一定的理论基础。采用磁珠法获得益生菌的黏附蛋白,通过量子点标记验证其黏附功能,是益生菌功能研究方面的一种创新。本研究将为今后开展益生菌的功能基因和蛋白的研究,提供一种方法学和新的思路。