快速检测大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析方法的建立

摘要

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是引起出血性肠炎和溶血性尿路综合症的主要致病菌。牛肉、奶制品、蔬菜等食物是其主要传播途径,除此之外,动物和人、人和人的接触也可能导致大肠杆菌O157:H7感染。由于其感染发病快、死亡率高,严重影响了人民的身体健康。因此,快速诊断大肠杆菌O157:H7具有重要的现实意义。本文旨在建立快速、特异性强、适用于大量样品和现场检测的大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析方法。
　　 本文采用全菌抗原和细胞碎片抗原分别免疫日本大耳兔,制备了抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体。获得的多克隆抗体效价达106。分别用辛酸-硫酸铵法和磁珠吸附法对多克隆抗体进行纯化,纯化后的抗体通过SDS-PAGE进行蛋白分析,并用斑点杂交对纯化后的抗体进行特异性分析。结果显示,辛酸-硫酸铵法纯化后的抗体仍有较多的杂蛋白,而磁珠吸附法能有效去除这些杂蛋白,得到较纯的抗体。纯化后的多克隆抗体均与其它一些细菌有交叉反应。
　　 本文采用胶体金标记商品化的单克隆抗体,通过把多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线(T线)和质控线(C线),研制了大肠杆菌O157:H7胶体金快速检测试纸条,并对其进行了评价。通过实验,确定了试纸条工艺条件如下:标记pH为8.0、蛋白标记量为25μg／mL、金标抗体离心转速为4000 r／min、胶体金封闭剂为PEG20000、T线喷涂浓度为1 mg／mL、C线喷涂浓度为1.5 mg／mL。用纯培养细菌对试纸条的灵敏度和特异性进行了评价,结果显示试纸条的灵敏度为105个细胞／mL,试纸条除与金黄色葡萄球菌(CMCC26003)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC13311)有弱阳性反应外,与其它24株常见的细菌无交叉反应。37℃加速保存实验结果表明,本试纸条常温保质期在15个月以上。在25 g牛肉或莴苣样品中添加10～100 CFU的目的菌,37℃增菌6 h后,试纸条检测为阳性结果。
　　 为了进一步提高试纸条的特异性和灵敏度,本文采用提取的大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白免疫Balb／c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆化共得到4株能稳定分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了相应的腹水。配对结果显示,有5对抗体可用于试纸条的制备。