OPN与乳腺癌细胞体外形成血管生成拟态关系的研究

摘要

目的：
　　 骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)在人类乳腺癌细胞中高表达，并可能参与了某些肿瘤细胞血管生成拟态(Vasculogenic mimicry，VM)的形成。在本项研究中，我们调查OPN是否在乳腺癌细胞的VM形成中起作用，并探讨OPN和VM形成相关蛋白MMP-9和VEGF之间是否有关联。
　　 方法：
　　 1、运用脂质体转染技术，将针对OPN编码基因的不同序列的重组质粒miR-opn1、miR-opn2、miR-opn3、miR-opn4分别转染至人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，WB检测挑选沉默效率最高的质粒进行后续实验。
　　 2、实验分组：正常组(contro1)、转染试剂对照组(LipLTX)、阴性质粒对照组(miR-neg)和转染组(miR-opn2)，分别转染乳腺癌细胞株30h后，收集细胞进行体外三维培养，24h后倒置显微镜下观察各组VM的数量，并通过PAS染色证实VM的存在。
　　 3、三维培养24h后，提取各实验组细胞，用RT-PCR、Western Blot技术测定OPN、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白质的表达量。
　　 结果：
　　 1、miR-opn1、miR-opn2、miR-opn3和miR-opn4分别转染至人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，荧光显微镜观察结果和WB实验结果显示，miR-opn2质粒的沉默效率较其他组高，可进行后期实验。
　　 2、转染组(miR-opn2)的MDA-MB-231细胞株形成VM的数量比正常组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的明显减少(P<0.05)，正常组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组组间相比无显著性差异，说明OPN参与了MDA-MB-231细胞株的VM形成。
　　 3、转染组(miR-opn2)的MDA-MB-231细胞株OPN、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达水平均比正常组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组(miR-neg)明显下降(P<0.05)，正常组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组(miR-neg)组间相比无显著差异，提示OPN参与VM的形成很可能是通过影响VM生成相关蛋白MMP-9和VEGF实现的。
　　 结论：
　　 1、体外三维培养模型中人乳腺癌细胞株MDA-MB-231能够形成典型的PAS染色阳性的VM现象。
　　 2、靶向沉默OPN蛋白能够有效抑制体外三维培养模式中MDA-MB-231形成VM的数量，提示OPN蛋白参与了VM的形成。
　　 3、OPN参与VM的形成很可能是通过影响VM生成相关蛋白MMP-9和VEGF实现的。