二甲双胍和甘精胰岛素对人子宫内膜癌Ishikawa细胞株增殖作用的影响及其相关机制研究

摘要

研究背景和目的:
　　二甲双胍是一种经典的降糖药物，被国内外多个权威糖尿病学术组织（如ADA，EASD，IDF, CDS等）推荐为糖尿病一线治疗的最佳选择，其有效性及安全性已得到广泛的认同.近年研究显示，二甲双胍具有抑制肿瘤生长的作用，而其具体作用机制尚不完全清楚[1]。胰岛素类似物作为传统胰岛素替代物，能够较好的模拟生理胰岛素分泌模式，因而在临床上广泛应用。其中，甘精胰岛素在分子结构上的改变与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)分子具有同源性，体外研究显示[2]，促有丝分裂作用是人胰岛素的8倍。既往有研究显示，甘精胰岛素可能增加肿瘤风险网。临床治疗中，长效胰岛素类似物与双胍类药物联用是常见的治疗方案。二者联合除了血糖平稳达标的优势外，是否能够在糖尿病患者恶性肿瘤的发生风险中发挥正面作用，是临床医生及科研工作者值得思考的问题。
　　本研究通过探讨二甲双胍、甘精胰岛素及二者联合对子宫内膜癌Ishikawa细胞株增殖、凋亡及雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)基因表达的影响，从细胞和基因水平分析二甲双胍和甘精胰岛素对子宫内膜癌生长及增殖的影响，并观察二甲双胍是否能够抑制或阻断甘精胰岛素促肿瘤细胞增殖的作用。从而为合理选择临床降糖治疗方案，更加合理的使用胰岛素及其类似物提供实验基础，亦可为进一步探讨降糖药物的抑癌机制提供一些参考。
　　研究内容和方法:
　　1、细胞培养:人子宫内膜癌Ishikawa细胞常规培养、扩增、传代。
　　2、实验分组及药物干预:取对数生长期的Ishikawa细胞，不同浓度二甲双胍、甘精胰岛素及二者联合干预不同时间;对照组加入等体积不含药物培养液。
　　3、CCK-8试剂盒检测细胞增殖。
　　4、流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　5、荧光定量PCR测定雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)基因表达量。
　　6、统计学处理:数据用(x)±s表示，应用SPSS17.0统计软件，多组间比较进行单因素方差分析，两两比较进行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、不同浓度组甘精胰岛素、二甲双胍及两者联合对细胞增殖的影响
　　1.1不同浓度甘精胰岛素处理不同时间后，与对照组相比，各干预组均有不同程度增殖，不同时间增殖幅度差异不大(P＞0.05)，不同浓度之间增幅差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　1.2不同浓度二甲双胍处理不同时间后，与对照组相比，各干预组增殖率明显降低，其下降幅度与药物浓度和干预时间成正相关。差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　1.3100IU/L甘精胰岛素作用72h后分别加入不同浓度二甲双胍干预24h，与甘精胰岛素干预组及对照组相比，增殖幅度大幅下降，其下降程度与二甲双胍干预浓度呈正比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、不同浓度组甘精胰岛素、二甲双胍及两者联合对细胞凋亡的影响
　　二甲双胍组较甘精胰岛素组有更高的凋亡率，二甲双胍浓度越高，其凋亡率越高，差异有统计学意义。甘精胰岛素各浓度组间差异不明显，但对细胞晚期凋亡率的影响更大。甘精胰岛素联合二甲双胍组显示二甲双胍在甘精胰岛素环境下仍可明显促进细胞凋亡，其程度与二甲双胍浓度成正比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、不同浓度组甘精胰岛素、二甲双胍及两者联合对mTOR基因表达量的影响
　　与对照组相比，甘精胰岛素组mTOR基因表达明显升高，与作用浓度成正比，差异有统计学意义。中、高浓度二甲双胍组mTOR表达较空白对照组有所下降，最高降幅在35.7％左右。联合组与甘精组(100Iu/l)相比，mTOR的表达有明显降低(62.9％-101.6％)(P＜0.005);甘精联合二甲双胍组与二甲双胍组同等浓度相比，差异并不明显(P＞0.437)。
　　结论:
　　1、二甲双胍在体外可以较大幅度抑制人子宫内膜癌细胞增殖，促进其凋亡，降低mTOR基因表达。其程度与药物干预浓度及作用时间相关。
　　2、甘精胰岛素在体外可一定程度上促进人子宫内膜癌细胞增殖，降低细胞凋亡率，与药物浓度呈正相关，与作用时间关系不显著。甘精胰岛素可在一定程度上上调mTOR基因在子宫内膜癌细胞中的表达。
　　3、二甲双胍可以在一定程度上降低甘精胰岛素对子宫内膜癌细胞的促增殖及抗凋亡作用，并下调mTOR基因的表达，在高浓度组（20mmol/l），此作用最显著。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

1．1 2型糖尿病与恶性肿瘤发生风险

1．2 2型糖尿病、胰岛素抵抗与IGF-1在子宫内膜癌中的意义

1．3 二甲双胍与肿瘤

1．4 甘精胰岛素与细胞增殖

1．5 二甲双胍、甘精胰岛素在临床中的联合应用及其共同信号通路

第2章 材料与方法

2．1 主要材料及试剂

2．1．1 实验细胞株

2．1．2 主要试剂、产地

2．1．3 主要仪器设备和产地

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 分组及药物干预

2．2．3 CCK-8试剂检测细胞增殖

2．2．4 流式细胞仪检测细胞凋亡

2．3 数据分析

第3章 结果

3．1 二甲双胍和甘精胰岛素对Ishikawa细胞增殖的影响

3．1．1 二甲双胍对Ishikawa细胞增殖的影响

3．1．2 甘精胰岛素对Ishikawa细胞增殖的影响

3．1．3 甘精胰岛素联合二甲双胍对Ishikawa细胞增殖的影响

3．2 二甲双胍、甘精胰岛素及两者联合对细胞凋亡的影响

3．2．1 二甲双胍对Ishikawa细胞凋亡的影响

3．2．2 甘精胰岛素对Ishikawa细胞凋亡的影响

3．2．3 甘精胰岛素联合二甲双胍对Ishikawa细胞凋亡的影响

3．3 二甲双胍及甘精胰岛素对人子宫内膜癌细胞表达mTOR的影响

3．3．1 RT-PCR检测引物特异性及条带均一性

3．3．2 荧光定量PCR检测mTOR表达量

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述 二甲双胍对恶性肿瘤抑制作用的研究进展