microRNA对多巴胺能神经元分化的调节

摘要

帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)主要是因位于中脑“黑质”部位的细胞发生病理性改变后中脑黑质多巴胺能神经元(dopaminergic neuron，DA neuron)缓慢发生选择性死亡或纹状体多巴胺含量显著减少引起的。由于PD发生的根本原因是多巴胺能神经元数量的剧减导致其释放的DA递质含量不足，因此，对DA神经元分化的调控研究具有潜在的医学研究意义和临床应用价值。
　　 Nr4a2/Nurr1是超家族转录因子的成员之一，它在腹侧中脑及中脑多巴胺神经元中高表达。已有研究报道Nr4a2/Nurr1（nuclear receptor-related factor1）是细胞核受体相关因子1，与多巴胺能神经元的发生具有密切联系，是决定多巴胺神经元的发育和分化的一个最重要的转录因子之一。目前，有文献报道microRNAs(miRNAs)对多巴胺能神经元分化的转录子Nr4a2/Nurr1具有表达调控的作用。microRNAs(miRNAs)是一类长度约为20-25nt的内源性单链非编码RNA，主要在转录后水平参与基因调控，在各种生命活动中起重要作用。因此，系统研究microRNA对转录因子Nr4a2/Nurr1的调控作用，可以深入了解多巴胺神经元分化的机制，探索microRNA作为核酸调控分子在帕金森氏病发生发展中的作用。
　　 本文利用Dual-luciferase assays system，通过双荧光素酶报告基因的检测，初步筛选出对Nr4a2/Nurr1具有明显调控作用的miR-17、miR-183、miR-211、miR-106b、miR-20a、miR-19a和miR-206b。发现miR-17、miR-183、miR-211、miR-106b和miR-20a对靶基因NR4A2的抑制效果与对照组比较具有显著差异性(0.01＜P＜0.05)。
　　 根据双荧光素酶报告基因的检测的结果，我们将有调控作用的miRNA和对照miRNA克隆到慢病毒lenti表达载体中。在体外将这些慢病毒载体通过磷酸钙转染法转染293T细胞，获得了表达miR-17、miR-183、miR-211、miR-106b、miR-19a、miR-20a和对照miRNA的病毒。
　　 Western Blotting检测显示，与对照相比，过表达miR-17、miR-183、miR-106b的神经干细胞中靶基因Nr4a2的表达有明显的下降，而过表达miR-19a、miR-20a和miR-211的神经干细胞中，其靶基因Nr4a2的表达与对照相比无显著差异。
　　 real-time-PCR分析显示，在过表达miR-17和miR-183的神经干细胞中，靶基因NR4A2在转录水平极显著下调(p＜0.01)，过表达miR-106b的神经干细胞中Nr4a2/Nurr1的表达显著下调(p＜0.05)，而miR-211则对靶基因NR4A2具有显著上调作用(p＜0.01)。
　　 采用real-time-PCR检测胚胎干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化过程中miRNA对Nr4a2/Nurr1、TH、β-Tubulin基因的表达调控作用，结果表明:miR-17和miR-183通过下调靶基因Nr4a2/Nurr1的表达而影响多巴胺神经元标志基因TH和神经元标志基因β-Tubulin的表达。
　　 通过上述研究，我们发现miR-17和miR-183通过调控转录因子Nr4a2/Nurr1的表达从而影响多巴胺神经元的产生，证实了miRNAs与帕金森氏病的发生是紧密联系的，这为帕金森氏病病的治愈及新药的研发提供了新思路。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 选题背景和研究意义

1．2 帕金森氏病的介绍

1．2．1 帕金森氏病的发病机制及病理特征

1．3 多巴胺及多巴胺能神经元

1．4 NR4A2／Nurr1与多巴胺能神经元

1．5 microRNA简介及作用机制

1．6 miRNA在多巴胺能神经元的生物学作用

1．7 miRNA对帕金森氏病的影响

1．8 多巴胺能神经元的分化研究进展

第2章 材料与方法

3．2 仪器和设备

2．1．1 仪器和设备

2．1．2 试剂和耗材

2．1．3 引物序列

2．1．4 质粒构建

2．1．5 动物、细胞和质粒

第3章 实验方法

3．1 实验总思路

3．2 293T细胞培养

3．2．1 293T细胞复苏

3．2．2 293T细胞的传代

3．3 小鼠神经干细胞(NPC)培养

3．3．1 小鼠神经干细胞(NPC)原代培养

3．3．2 小鼠神经干细胞(NPC)传代培养

3．3．3 神经干细胞克隆球染色(干性鉴定)

3．4 MEF饲养层的制作

3．4．1 MEF细胞的获得

3．4．2 MEF细胞传代培养

3．4．3 MEF细胞γ射线处理

3．5、ES细胞培养

3．5．1 ES细胞复苏

3．5．2 ES细胞传代培养

3．6 luciferase检测

3．6．1 293T细胞的传代培养

3．6．2 miRNA与靶基因NR4A2共转染

3．6．3．Luciferlase检测

3．7 lenti-miRNA分子克隆构建

3．7．1 质粒提取

3．7．2 Top质粒、lenti载体酶切和酶连

3．7．3 转化和挑克隆摇菌

3．7．4 测序和比对

3．7．4 保种

3．7．5 中提质粒

3．8 慢病毒转染与感染

3．8．1 病毒转染

3．8．2 病毒感染

3．9 Western Blotting检测靶基因NR4A2表达

3．9．1 细胞收集、蛋白提取及测定

3．9．2 Western Blotting蛋白检测NR4A2蛋白表达

3．10 q-PCR检测目的基因的NR4A2表达

3．10．1 RNA提取

3．10．2 RT-PCR(逆转录PCR)

3．11 小鼠ES向多巴胺能神经元的自发分化

3．12 ES向多巴胺能神经元的诱导分化

3．13 QPCR检测ES向多巴胺能神经元分化结束后基因的表达

3．14 胚胎中脑干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

第4章 结果与分析

4．1 Luciferase检测

4．1．1 293T细胞的贴壁培养

4．1．2 Luciferase检测

4．2 lenti-miRNA克隆构建

4．3 慢病毒包装转染293T细胞

4．4 NPC克隆球染色鉴定

4．4．1 NPC细胞悬浮培养

4．4．2 NPC克隆球干性鉴定

4．5 病毒感染NPC

4．5．1 NPC贴壁培养

4．5．2．病毒感染

4．5 NR4A2的western blotting检测

4．6 NR4A2的real-time-PCR检测

4．7 ES分化

4．7．1 ES培养

4．7．2 悬EB球(拟胚体)

4．7．3 ES自发分化

4．7．4 多巴胺能神经元的诱导分化

4．8 ES细胞向多巴胺能神经元分化的real-time-PCR检测

4．9 中脑干细胞诱导分化多巴胺能神经元

第5章 讨论

5．1 EB球贴壁感染病毒后出现的问题

5．2 分化效率不稳定的原因

5．3 纯化多巴胺能神经元

5．4 miRNAs对多巴胺能神经元分化影响的结果分析

5．5 miRNAs作为新兴生物药物治疗帕金森疾病的展望

致谢

参考文献