尼罗罗非鱼cyp19a1a多克隆抗体制备及高温诱导对其表达的影响

摘要

芳香化酶参与哺乳动物中枢神经系统的发育,调节神经内分泌,影响性行为和繁殖功能;并且可以调控非哺乳动物性腺分化,影响多种鱼类的性别分化和性别决定。芳香化酶由芳香化酶基因cyp19a1编码,在尼罗罗非鱼中,存在两种芳香化酶基因,分别为性腺型芳香化酶基因(cyp19a1a)和脑型芳香化酶基因(cyp19a1b),他们分别编码性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB)。其中性腺型芳香化酶主要在性腺中,在其它组织中很少表达甚至不表达。为了了解高温对尼罗罗非鱼性别分化相关基因表达的分子调控机制,本文通过RT-PCR技术获得尼罗罗非鱼cyp19a1a ORF区,并进行了原核表达,纯化了重组蛋白,免疫小鼠制备了多克隆抗体。对尼罗罗非鱼进行36℃高温处理,分析高温诱导前后尼罗罗非鱼性腺中cyp19a1a蛋白表达的变化情况。同时体外培养尼罗罗非鱼卵巢细胞,并对卵巢细胞进行高温处理,qRT-PCR分析离体情况下cyp19a1a以及hsp70的变化情况。
　　1、从尼罗罗非鱼卵巢提取总RNA,反转录获得cDNA模板后,利用设计的引物PCR扩增cyp19a1a ORF区1200bp片段,将扩增得到目的片段进行双酶切并连接到pET-28a(+)表达载体上,经酶切验证和DNA测序鉴定后证明成功构建了pET-28a-cyp19a1a原核表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌BL21中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间,结果显示在0.5mM/L IPTG诱导8h后cyp19a1a重组蛋白大量表达,并以包涵体形式存在。通过Ni2+-NTA层析柱和切胶纯化后获得与预期片段大小一致的表达蛋白,并用Western blotting验证了纯化的蛋白是目的蛋白。将纯化的pET-28a-cyp19a1a重组蛋白注入昆明白小鼠内并成功获得多克隆抗体。用Western blotting验证了多克隆抗体的有效性。用所得抗血清检测高温诱导前后尼罗罗非鱼性腺中cyp19a1a的表达变化情况,发现高温诱导后cyp19a1a的表达量显著降低。
　　2、利用组织块贴壁法培养了尼罗罗非鱼卵巢细胞,结果显示尼罗罗非鱼卵巢细胞能在含15％ FBS和5%鱼血清的L-15培养液及29℃的培养条件下正常生长并具有连续传代能力。同时,qRT-PCR分析37℃高温诱导下尼罗罗非鱼及体外培养卵巢细胞的hsp70和cyp19a1a基因的表达水平,结果显示,高温诱导能显著上调罗非鱼卵巢hsp70的表达量,而在体外培养的卵巢细胞中hsp70表达量也呈上升趋势但不显著,这说明体外尼罗罗非鱼卵巢细胞对热应激敏感;然而,高温诱导对尼罗罗非鱼卵巢细胞cyp19a1a的表达水平无显著影响,这暗示了高温对cyp19a1a表达水平的影响可能需要其它蛋白或其它性别相关基因(foxl2、sox9、dnmt1等)的协同作用。

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第 1 章 引言

1.1 尼罗罗非鱼研究现状

1.2 鱼类性别决定与性别分化

1.3 环境对鱼类性别的影响

1.4 鱼类性逆转研究现状

1.5 罗非鱼卵巢细胞培养

1.6 热休克蛋白研究进展

1.7 本论文的研究目的和意义

第2章 尼罗罗非鱼Cyp19a1a蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

第 3 章 尼罗罗非鱼卵巢细胞的建立及高温诱导对 Cyp19a1a体外表达的影响

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第 4 章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间的研究成果