外源补偿高温下调的雌二醇水平对尼罗罗非鱼性比及Cyp19a1a表达的影响研究

摘要

鱼类性别的可塑性很强，极易受体内雌、雄激素的影响。已有研究表明雌激素在鱼类性别分化中起着重要作用，无论鱼由雌转雄还是由雄转雌的性逆转过程，都伴随着雌激素水平的下调或者上调。在鱼类性别分化关键时期，雌激素在鱼体内的合成早于雄激素的合成，那么与之适应的，性腺中催化雌激素合成酶(芳香化酶)的表达也早于催化雄激素合成酶的表达。如尼罗罗非鱼的性别决定受遗传和温度的双重控制，被称为遗传性别决定和温度性别决定的混合型。尽管已有研究报道在尼罗罗非鱼性别分化关键时期，通过高温(36℃)诱导雌鱼性逆转为雄鱼，在此过程中伴随着体内雌激素浓度的下降和雌激素合成酶基因Cyp19a1a表达的下调。但是通过添加外源雌激素和高温共同处理雌鱼，能否改变体内激素水平和Cyp19a1a表达水平，以及对性别比例产生怎样的影响，目前还不清楚。本试验拟在尼罗罗非鱼性腺分化时期，通过浓度梯度的外源雌激素和高温同时处理尼罗罗非鱼雌鱼，比较分析处理组之间性类固醇激素水平和群体雌性率，筛选出本试验中外源雌激素补偿浓度。并分析该最适补偿浓度的外源雌激素与高温共同处理对尼罗罗非鱼早期性腺中雌激素合成相关基因（Cyp19a1a）表达的影响。 本研究中，利用野生雌鱼与伪雄鱼自然产卵受精，获得3个尼罗罗非鱼全雌家系。分别设置雌鱼对照组，雄鱼对照组，高温（36℃）处理组和不同浓度的雌二醇（E2）补偿组（高温和E2共处理），对比分析各处理组在性别分化早期性腺中E2和11-KT水平。结果显示，在13dpf，尼罗罗非鱼性腺中的E2水平在XX+HT+E:（16、64）组较对照组显著升高，在其余处理组中没有显著性差异。在21dpf，雄鱼性腺内E2水平显著低于雌鱼，同时高温处理组也显著降低了性腺中E2水平，降低到对照雌鱼性腺中E2水平的一半，但是在XX+HT+E:4组的E2水平却接近于对照雌鱼。E2补偿组随着添加外源E2浓度的升高其性腺中E2水平也随之升高。在尼罗罗非鱼性别分化早期（13dpf和21dpf）性腺中11-KT水平较低，且未发生改变。通过比较分析各处理组在性腺成熟后的群体雄性率发现，在XX+HT+E:4组中，4μg/L的E2处理升高了高温处理组下降的39.7%雌性率，并且其雌性率与雌鱼对照组接近，在各处理组的E2水平和雌性率对比分析表明，在本试验中雌激素补偿组中最适E2补偿浓度为4μg/L，且在尼罗罗非鱼早期性腺中的雌激素水平对其性别分化具有关键性作用。与之适应，最适E2补偿与高温处理对尼罗罗非鱼早期性腺中雌激素合成相关基因会产生怎样的影响? 在尼罗罗非鱼性别分化过程中，性腺芳香化酶Cyp19a1a是催化其体内雌激素合成的关键限速酶。本实验中，在尼罗罗非鱼性别分化早期，使用qRT-PCR和原位杂交（ISH）对性腺芳香化酶Cyp19a1a表达水平进行检测与分析。结果显示，与雌鱼对照组相比，高温处理组显著下调了尼罗罗非鱼性腺芳香化酶Cyp19a1a表达水平。而最适E2补偿组性腺芳香化酶Cyp19a1a表达水平又恢复到与雌鱼对照组相近的水平，即最适E2处理与高温诱导对性腺芳香化酶Cyp19a1a表达有着同等效力却相反的结果。 综上所述，本研究初步证明，在尼罗罗非鱼性别分化关键时期，高温诱导尼罗罗非鱼雌鱼性逆转与鱼体内的雌激素浓度的下降相关联。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1尼罗罗非鱼简介

1.2鱼类性别分化机制

1.3遗传因素对鱼类性别分化的影响

1.4温度因素对鱼类性别分化的影响

1.5类固醇激素对鱼类性别分化的影响

1.5.1雌激素对鱼类性别分化的作用

1.5.2雄激素对鱼类性别分化的作用

1.6鱼类性逆转研究现状

1.6.1雌鱼性逆转为雄鱼的研究现状

1.6.2雄鱼性逆转为雌鱼的研究现状

1.7本研究的目的与意义

2 材料和方法

2.1试验材料

2.1.1建立尼罗罗非鱼全雌家系

2.1.2试验组设置

2.1.3样品采集和保存

2.2试验试剂与仪器

2.2.1试验试剂

2.2.2试验仪器

2.3试验方法

2.3.1切片材料收集与保存

2.3.2性腺总RNA的提取和保存

2.3.3酶联免疫法检测体内E2和11-KT水平

2.4.4性腺的组织学检测

2.3.5原位杂交验证

2.3.6 qRT-PCR步骤

2.4数据统计

3 结果与分析

3.1 各处理组13dpf尼罗罗非鱼仔鱼性腺中E2和11-kt水平比较

3.2 各处理组21dpf尼罗罗非鱼仔鱼性腺中E2和11-kt水平比较

3.3各处理组雌性率比较分析

3.4 qRT-PCR检测各处理组仔鱼性腺中Cyp19a1a表达量

3.5原位杂交分析各处理组仔鱼性腺中Cyp19a1a表达水平

4 讨论

4.1外源雌激素对高温诱导尼罗罗非鱼体内E2和11-KT水平的影响

4.2 外源雌激素和高温共同处理对尼罗罗非鱼的性别表型的影响

4.3最适外源雌激素补偿高温诱导对尼罗罗非鱼Cyp19a1a基因的表达

5结论

参考文献

致谢