米曲霉中性蛋白酶基因在毕赤酵母中的重组表达及定向进化

摘要

米曲霉中性蛋白酶(neutral protease)是米曲霉在代谢过程中产生的酶系,主要用于酱油酿造生产中,以大豆或豆粕及小麦或面粉为主要原料,经过蛋白酶的分解作用,将蛋白质发酵水解成多种氨基酸,再结合其它的发酵产物,经过复杂的生物化学反应,形成具有特殊色泽、滋味和体态的调味液。毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种单细胞真核生物,为甲醇营养型,近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白,能对许多蛋白进行分泌表达,并产生各种不同的翻译后修饰过程,如多肽的折叠、糖基化、甲基化、酰化作用等。毕赤酵母表达外源蛋白过程中发生的糖基化现象是一种十分重要的翻译后修饰过程,它能对蛋白质合成过程中的折叠、组装、结构稳定性、特定信号转导、识别和分泌等产生的一系列作用。基于非理性设计的定向进化技术能够使研究者们在实验室内模拟自然进化机制,将自然界需上亿年才能完成的进化缩短至几个月,在短期内创造出新的酶类。利用定向进化技术对米曲霉中性蛋白酶进行改造,并从中筛选出理想的突变型,可有效改善蛋白酶在工业生产中的应用,最终为提高原料蛋白质利用率及改善酱油风味,降低生产成本奠定基础。主要研究结果如下:
　　1、中性蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化及性质分析
　　构建了 pPIC9K-NPI-6His表达载体,转入毕赤酵母 GS115并利用BMGY/BMMY培养基诱导表达,诱导培养72 h时表达上清酶活达到最高,为46 U/mL。对表达的重组中性蛋白酶进行硫酸铵沉淀及镍柱纯化,SDS-PAGE分析纯化效果良好,蛋白大小为55 kDa。对纯化后重组中性蛋白酶进行酶学性质分析:其最适反应pH为7.5,在pH7.0的时候稳定性最好;最适反应温度为55 oC,对其进行热稳定性测定,50 oC以下对酶活影响不大,置于60 oC时保温1 h后,表达的中性蛋白酶完全失活;金属离子 Ca2+、 Mg2+、 Li+等对中性蛋白酶酶活影响不大,但 Zn2+、Cu2+的加入则使中性蛋白酶酶活下降显著,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对酶活无影响,但金属离子蛋白酶抑制剂EDTA和Phen使蛋白酶完全失活,表面离子活性剂TritonX-100使中性蛋白酶酶活稍有下降。
　　2、重组中性蛋白酶的糖基化分析
　　对纯化后的NPI进行糖基化现象的确定及糖基化位点的鉴定。PAS染色法及Endo H去糖基化处理法确定了NPI重组蛋白发生了糖基化现象,去糖基化前后蛋白分子量经 MALDI-TOF-MS测定分别为54.5 kDa和43.3 kDa,nano LC MS/MS鉴定到其成熟肽段第41位氨基酸Asn为糖基化发生位点。利用I-TASSER对NPI蛋白进行三维结构模拟,发现该糖基化位点位于一处loop环结构上,与NPI蛋白酶活性中心相距较远。利用定点突变技术构建了N41A去糖基化突变株,通过去除表达过程中的糖基化现象来研究糖基化作用对表达的蛋白酶酶活的影响。突变后蛋白分子量大小降至43 kDa左右,通过测定突变前后中性蛋白酶酶活并进行比较,发现非糖基化的中性蛋白酶几乎完全丧失酶活,由此证明糖基化作用在NPI表达过程中产生了重要影响。
　　3、提高重组中性蛋白酶热稳定性的定向进化
　　利用易错PCR的方法成功构建了NPI毕赤酵母随机突变文库,其库容量为2×104个重组酵母转化子,50％的重组子仍具有中性蛋白酶活力。在构建的随机突变文库中成功筛得一株热稳定性提高的突变体酶,其最适反应温度由野生株的55 oC提高至60 oC,突变后的酶液56 oC半衰期由野生株的7.9 min增长至16.7 min,为野生株的2.1倍。对野生型NPI蛋白及S93A突变后NPI蛋白进行三维结构模拟,分析氨基酸突变对蛋白结构的影响。通过两者结构对比发现,第93位氨基酸位于NPI蛋白的一处α-螺旋结构上,Ser突变为Ala后,与其它氨基酸之间增加了两处氢键作用力,且与93位氨基酸前后的非极性氨基酸丙氨酸(Ala)和异亮氨酸(Ile)形成了新的疏水作用力A92-A93和A93-I94,促进NPI蛋白热稳定性提高。

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第1章 文献综述

1.1米曲霉中性蛋白酶

1.2重组中性蛋白酶的表达

1.3 提高中性蛋白酶热稳定性的分子改造

第 2 章 重组中性蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化及性质分析

2.1 引言

2.2材料

2.3 方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

第 3 章 重组中性蛋白酶的糖基化分析

3.1 引言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 小结

第 4 章 提高重组中性蛋白酶热稳定性的定向进化

4.1 引言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 小结

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果