siRNA干扰对高糖及AngⅡ环境下大鼠肾小管上皮细胞TLR4/Myd88信号通路的影响

摘要

目的:通过siRNA(RNAi)干扰技术选择性下调TLR4基因的表达,探讨高糖对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)Toll样受体4(Toll like receptor,TLR4)及其转接子髓分化因子88(myeloid differentiation88, MyD88)和炎性因子分泌的影响。
　　方法:常规培养细胞后将细胞分3组:1、正常糖组2、高糖组3、AngⅡ组,干预12小时后提取细胞总 RNA及总蛋白,采用荧光定量 PCR检测 TLR4、MyD88mRNA的表达,western blot检测TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表达水平的变化,分析高糖及AngⅡ对TLR4/MyD88信号通路的影响。设计并合成3对针对大鼠TLR4基因的特异性siRNA片段,以带有红色荧光的BLOCK-IT Alexa Fluor作为阴性对照,在荧光显微镜下观察细胞转染效率,转染成功后将细胞分组为1、正常糖组2、高糖+ AngⅡ组3、高糖+ AngⅡ+阴性对照组4、高糖+AngⅡ+siRNA1组5、高糖+AngⅡ+siRNA2组6、高糖+AngⅡ+siRNA3组,用PCR检测TLR4mRNA的表达变化,挑选基因沉默效率最佳的siRNA用于进一步实验,将细胞分组:1、正常糖组2、高糖+AngⅡ组3、高糖+AngⅡ+阴性对照组4、高糖+AngⅡ+siRNA组5、高糖+AngⅡ+厄贝沙坦组6、高糖+AngⅡ+厄贝沙坦+siRNA组,采用荧光定量 PCR检测 TLR4、MyD88mRNA的表达, western blot检测TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表达水平的变化,同时收集细胞上清液用ELISA法检测IL-6、及MCP-1的表达。
　　结果:高糖及 AngⅡ都可以上调 TLR4、MyD88mRNA及 TLR4、MyD88及NF-kB蛋白的表达水平(P<0.01)。siRNA技术可选择性下调TLR4mRNA的表达,以 siRNA3基因沉默效果最佳,与正常组相比,高糖+AngⅡ组 TLR4、MyD88及NF-kB蛋白及TLR4、MyD88mRNA表达明显上调(P<0.01),IL-6、及MCP-1的表达亦上调(P<0.01),阴性对照组与高糖+AngⅡ组差异无统计学意义(P>0.05),siRNA组及厄贝沙坦组TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表达明显下调,TLR4、MyD88mRNA明显下调,IL-6、及MCP-1的表达亦下调,且两者共同作用下效果增强(P<0.01)。
　　结论:高糖及AngⅡ刺激下可激活TLR4/MyD88信号通路,上调TLR4及下游炎性因子的表达,特异性siRNA基因沉默可以阻断由高糖及AngⅡ诱导的TLR4信号通路的激活,厄贝沙坦也可阻断TLR4信号通路的激活,TLR4信号通路在大鼠肾小管上皮细胞炎性反应机制中发挥关键作用,siRNA基因沉默技术为寻找糖尿病肾病的治疗方法提供了另一个路径。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1细胞株

2.1.2主要试剂

2.1.3 主要仪器及耗材

2.2 方法

2.2.1配置实验所需溶液

2.2.2 常规细胞实验方法，以下操作均在超净台内完成

2.2.3 细胞转染

2.2.4 实验分组

2.2.5 荧光定量PCR（Real-time PCR）检测各组TLR4、MyD88 mRNA的表达。

2.2.6 western blot分析各处理组TLR4、MyD88、NF-ΚB蛋白的相对表达量

2.2.7 ELISA分析细胞培养上清液中IL-6、MCP-1的表达量。

2.2.8 统计学处理

第3章 结果

3.1 第一部分实验结果

3.1.1荧光定量PCR检测TLR4、MyD88 mRNA相对表达量

3.1.2Western blot检测各组细胞TLR4、MyD88、NF-kBp56蛋白的表达：

3.2 第二部分实验结果3.2.1 转染效果观察

3.2.2琼脂凝胶电泳检测RNA溶度和纯度

3.2.3 荧光定量PCR检测TLR4、MyD88 mRNA相对表达量

3.3.1荧光定量PCR检测TLR4、MyD88 mRNA相对表达量

3..3.2 Western blot检测各组细胞TLR4、MyD88、NF-kBp56蛋白的表达：

3.3.3 ELISA检测各组细胞培养上清液IL-6、MCP-1的表达：

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述