PDCD5基因增强顺铂诱导肺癌细胞凋亡敏感性的体内外研究

摘要

目的:
　　本研究拟从体内和体外两个水平探索PDCD5基因对于顺铂诱导的A549细胞凋亡的作用及可能机制。
　　方法:
　　第一部分:体外培养人肺腺癌A549细胞,运用脂质体将PDCD5重组质粒转染细胞后,RT-PCR检测转染效率,MTT法及流式细胞仪检测PDCD5单独转染和联合顺铂处理后的细胞凋亡情况;Western blot法检测A549细胞及转染PDCD5重组质粒后的A549细胞中PDCD5、Bcl-2及Survivin蛋白的表达。
　　第二部分:建立裸鼠A549肺癌模型,将25只裸鼠随机分为5组:空白对照(N-null)组、脂质体-pcDNA3.1(lip-null)组、脂质体-PDCD5(lip-PDCD5)组、顺铂(DDP)组和联合治疗(PDCD5+DDP)组。观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线图;原位TUNEL法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI);免疫组化法检测PDCD5、Bcl-2、Survivin蛋白表达情况。
　　结果:
　　1、RT-PCR结果显示PDCD5成功转染入A549细胞,在A549/PDCD5组表达明显高于A549组及A549/neo组,差异具有统计学意义(P<0.05)。MTT及流式结果显示PDCD5联合顺铂处理后A549/PDCD5组细胞凋亡率明显高于A549/neo组和A549组。Western blot结果显示,PDCD5在A549/PDCD5组中表达明显高于A549组及A549/neo组,Bcl-2、Survivin蛋白则呈低水平表达。
　　2、与其他4组比较,PDCD5+DDP组的肿瘤体积明显减小(P<0.05),TUNEL结果显示AI明显升高(P均<0.05);与对照组、脂质体-pcDNA3.1组、脂质体-PDCD组、DDP组比较,脂质体-PDCD组、PDCD5+DDP组的PDCD5蛋白表达升高,Bcl-2、Survivin蛋白表达降低,PDCD5蛋白与Bcl-2、Survivin蛋白表达呈负相关(P<0.05)。
　　结论:
　　PDCD5对A549细胞的增殖具有明显的抑制作用及诱导凋亡的作用,可能通过Bcl-2、Survivin基因表达下调促进细胞的凋亡从而抑制肺癌的发生发展,且呈浓度及时间依赖性,同时PDCD5基因能增强顺铂诱导肺癌细胞凋亡的敏感性,为肺癌的基因治疗提供了一条新疗法。

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第1章 前 言

第一部分 PDCD5基因促进顺铂诱导的A549细胞凋亡

1.1 材料

1.1.1 实验仪器与设备

1.1.2 主要试剂

1.1.3 试剂配制

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 MTT法测定转染PDCD5后A549细胞对顺铂的敏感性

1.2.3 流式细胞仪检测转染PDCD5后顺铂作用A549细胞的凋亡情况

1.2.4 RT-PCR检测各组细胞mRNA表达差异

1.2.5 Western blot法检测各组细胞蛋白表达差异

1.2.6 统计学方法

1.3结果

1.3.1 RT-PCR检测转染效率

1.3.2 PDCD5促进A549细胞对顺铂的敏感性

1.3.3 Western blot检测PDCD5、Bcl-2、Survivin蛋白的表达

1.4 讨论

第二部分 PDCD5增强A549细胞顺铂敏感性的体内研究

2.1 材料

2.1.1主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 动物造模及处理

2.2.2免疫组化

2.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡

2.2.3 统计学方法

2.3 结果

2.3.1 裸鼠肿瘤体积生长曲线

2.3.2 免疫组化结果

2.3.3 TUNEL检测细胞凋亡结果

2.4 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述

参考文献