桑色素对酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶抑制机理的探讨

摘要

一直以来，人体皮肤病如黄褐斑、老年斑、妊娠斑等都是十分困扰人们的常见疾病，所以，美白祛斑化妆品和美白食品的研究受到广泛关注和发展。痛风(一种由过高的尿酸引起的疾病)已被联合国列为21世纪20大顽症之一，而且随着生活水平的提高、生活节奏的加快和人们的饮食结构的不合理，我国痛风的发病率逐年上升，现已高于世界平均水平。据报道，在人体中，酪氨酸酶主要是催化机体生成黑色素，其过量表达会使黑色素聚集，从而导致皮肤病的产生，所以，抑制酪氨酸酶的活性是祛斑美白的重要手段；黄嘌呤氧化酶是人体内产生尿酸过程中的一个关键性酶，是产生痛风的重要因素，因此，将黄嘌呤氧化酶作为药物的作用靶点，抑制其活性也是临床治疗痛风的主要途径。
　　近年来，科学工作者在祛斑和抗痛风药物合成、研发方面取得了一定的成果，然而，这些合成药物大部分具有一定的副作用，这在一定程度上限制了它们的应用。黄酮类化合物以其广泛的生物活性受到了人们的青睐，从植物黄酮类化合物中寻找和筛选有效的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂，进而为祛斑和痛风病治疗提供新的药物选择已受到科技工作者的普遍关注。本文分别以酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶作为靶点，运用多种现代分析技术如抑制动力学技术、荧光光谱技术、圆二色谱技术等，并结合分子模拟手段研究了常见黄酮类化合物桑色素对上述两种酶的抑制动力学和抑制机理，以期为桑色素在化妆品和抗痛风药物方面的开发应用提供科学依据，也为研究其它活性组分对酶的抑制作用提供方法借鉴和技术支持。
　　本文的主要研究内容和结果如下：
　　1.简要介绍了酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶的结构、催化功能和生理特性；概述酪氨酸酶抑制剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展。
　　2.以酪氨酸酶为靶点，采用抑制动力学方法、荧光光谱法和圆二色谱法，在pH6.8的磷酸盐缓冲体系中，研究了室温条件下桑色素对酪氨酸酶的抑制机制。抑制动力学研究结果表明，桑色素通过多相动力学过程可逆地与酶催化底物左旋多巴(L-DOPA)竞争性地结合到酪氨酸酶的活性中心，其半数抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为(8.13±1.21)×10-5L/mol、(7.32±0.36)×10-5L/mol，桑色素显示较强的酪氨酸酶抑制活性。荧光光谱法研究结果发现，桑色素主要通过氢键和范德华力结合到酪氨酸酶上的一个特定位置，形成基态复合物，从而静态地猝灭酪氨酸酶的内源荧光，在298K温度下的结合常数为8.10×104L/mol。两者之间可能发生了非辐射能量转移，结合距离为5.12nm。圆二色谱分析显示，桑色素的存在诱导了酪氨酸酶的β-折叠含量增加，α-螺旋、β-转角和无规则转曲的含量降低。分子模拟结果直观地展现出桑色素与酪氨酸酶的结合区域与结合模式，桑色素插入到酪氨酸酶的活性中心，与其周围的一些氨基酸残基His85、His94、His244、His259、Asn260、His263、Phe264、Met280、Gly281、Val283和His296等发生相互作用，并且形成了两个氢键。推测桑色素对酪氨酸酶的抑制机理可能是桑色素插入到酪氨酸酶的活性位点，不但占据了酪氨酸酶对底物L-DOPA的催化中心，阻碍了底物的进入，而且还诱导了酪氨酸酶构象的变化，直接导致酪氨酸酶的活性降低。
　　3.在pH7.5的磷酸盐缓冲液体系中，测定了桑色素对黄嘌呤氧化酶的抑制率和抑制类型，研究了桑色素与黄嘌呤氧化酶的结合特性，桑色素对黄嘌呤氧化酶构象的影响以及山奈酚对桑色素抑制黄嘌呤氧化酶活性的影响。实验结果表明，桑色素是一种较强的、可逆的混合型黄嘌呤氧化酶抑制剂，其IC50为1.35×10–5mol/L，抑制常数Ki和抑制系数α分别为1.21×10-5mol/L和1.94；桑色素在黄嘌呤氧化酶有一个结合位点，在298K时的结合常数Ka为3.22×104L/mol，该结合过程是一个吸热和熵驱动过程，疏水作用力是其作用的主要驱动力。分子对接发现，桑色素分子进入黄嘌呤氧化酶的疏水空腔，与活性中心(含Mo区域)周围的一些主要氨基酸残基Ser1075、Pro076、Asn768、Lys771、Leu648和Leu1014等发生作用。圆二色谱分析表明，桑色素与黄嘌呤氧化酶作用诱导了酶二级结构发生改变。桑色素抑制黄嘌呤氧化酶的活性可能一方面是由于桑色素结合到酶的疏水空腔中，占据了底物进入活性中心的通道，从而降低了黄嘌呤氧化酶对底物的催化速率；另一方面是由于桑色素结合到XO上，诱导XO的结构更加紧凑而不利于其活性中心暴露于反应环境中，从而降低了XO与底物的接触。另外，研究发现，在桑色素浓度为2.0×10-6mol/L、山奈酚浓度为2.0×10-6或8.0×10-6mol/L，和桑色素浓度为1.4×10-5mol/L、山奈酚浓度为8.0×10-6mol/L时，它们对黄嘌呤氧化酶具有良好的协同抑制效应，这可能是因为它们不仅占据了XO的活性中心，还占据了底物进入XO活性中心的通道，并且同时对XO的构象产生影响。
　　4.采用多种光谱方法结合分子模拟技术，研究了山奈酚对黄嘌呤氧化酶的抑制机理和木犀草素对山奈酚抑制黄嘌呤氧化酶活性的影响。实验结果表明，山奈酚是一种有效的可逆性黄嘌呤氧化酶抑制剂，能够与底物黄嘌呤竞争性的结合到黄嘌呤氧化酶的活性位点，其IC50和Ki分别为(2.18±0.02)×10-6mol/L和(6.77±1.02)×10-6mol/L。山奈酚通过静态猝灭过程与黄嘌呤氧化酶形成基态复合物，疏水作用是主要驱动力。山奈酚引起黄嘌呤氧化酶中酪氨酸和色氨酸残基所处微环境的极性增强，疏水性降低，α-螺旋和无规则卷曲的含量降低，β-折叠和β-转角含量升高。分子模拟结果显示，山奈酚插入到黄嘌呤氧化酶的疏水空腔，与周围的一些主要氨基酸残基如Glu802、Leu873、Phe914、Arg880、Phe1009、Thr1010、Val1011、Leu1014和Pro1076等发生作用，并与Asn768和Luz1(与Mo原子相连的辅酶因子)形成了两个氢键。山奈酚对黄嘌呤氧化酶的抑制作用机制很可能是因为山奈酚插入到黄嘌呤氧化酶的活性位点，不但占据了黄嘌呤氧化酶的催化中心，阻碍了底物黄嘌呤的进入，还诱导黄嘌呤氧化酶的构象发生变化，直接导致黄嘌呤氧化酶的催化活性的降低。此外，研究还发现，在山奈酚浓度为0.5×10-6mol/L，山奈酚浓度为2.0×10-6mol/L、木犀草素浓度为1.0×10-6或5.0×10-6mol/L，山奈酚浓度为8.0×10-6mol/L、木犀草素浓度为1.0×10-6mol/L时，它们对黄嘌呤氧化酶的抑制具有协同效应，推测山奈酚和木犀草素均能结合到XO的活性中心，更大程度的占据了XO与底物黄嘌呤的结合位点，并且两者都引起了XO构象的变化，更加不利于XO活性中心的形成。

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缩写符号与代号

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 酪氨酸酶(TY)

1.3 黄嘌呤氧化酶(XO)

1.4 桑色素简介

1.5 主要研究方法

1.6 研究意义

1.7 研究内容

第2章 桑色素对酪氨酸酶的抑制作用

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 桑色素对黄嘌呤氧化酶的抑制作用及山奈酚的影响

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 山奈酚抑制黄嘌呤氧化酶活性的机理探讨

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间的研究成果