利用CRISPR/Cas9n系统对中脑多巴胺能神经元进行特异性标记

摘要

帕金森病（PD）是一种较常见的、能给人类生活带来严重影响的神经系统疾病，目前尚无法被根治。其主要病理标志是中脑黑质致密部（SNpc）表达酪氨酸羟化酶（TH）的多巴胺能神经元渐进性消失。细胞治疗是目前最有希望能显著改善PD患者生存质量的治疗手段之一，在实现细胞治疗前我们有必要对所能获得的DP神经元进行全方位的了解，尽管现在已经建立起许多啮齿类动物PD研究模型，并能体外诱导得到少量多巴胺（DP）神经元用以研究，甚至能用人的特异性启动子特异性标记小鼠DP神经元，但目前仍未能标记并获得纯的人类DP神经元以便深入研究，阻碍了对人类PD的攻克和对DP神经元的研究。
　　本文为了解决这一重要问题，在无异种动物源性培养条件下，结合最新、高效、便捷、成本较低且脱靶率更低的基因编辑系统——CRISPR/Cas9n系统，成功建立了携带体外克隆的TH短启动子驱动的ZsGrenn基因的hES细胞系，并在由该细胞系诱导而来的DP神经元中特异性表达荧光蛋白，实现了DP神经元的特异性标记，为接下来获得纯的人类DP神经元并对其进行深入研究奠定了基础。

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第1章 前言

1.1 帕金森病与多巴胺能神经元

1.2 CRISPR/Cas基因编辑系统与多巴胺能神经元的标记

第2章 实验材料

2.1 实验设备、材料及试剂

2.2 引物序列

2.3 质粒及载体信息

2.4 细胞来源

第3章 实验方法

3.1细胞培养冻存与复苏

3.2 基因组DNA及质粒DNA提取

3.3 CRISPR/Cas9n 标记载体系统的构建

3.4细胞转染及筛选

3.5 评估突变效率

3.6 hESC向DP神经元的诱导分化

3.7 细胞免疫染色

第4章 结果与分析

4.1 无饲养层培养的hESC干性鉴定

4.2 CRISPR/Cas9n标记载体系统的构建

4.3 CRISPR/Cas9n标记系统在HEK293FT细胞中的验证

4.4 CRISPR/Cas9n标记系统建立携带DP神经元特异性启动子的hES细胞系

4.5 实现DP神经元的特异性标记

第5章 讨论

5.1 结果与讨论

5.2 问题与展望

致谢

参考文献