富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白对自噬的调节及其机制的研究

摘要

肿瘤是是目前致死率最高的疾病之一，它是由非正常和不可控的一类细胞（肿瘤细胞）形成，随着生长肿瘤会逐渐侵犯正常组织以及产生远处转移最终造成机体功能的损害。研究发现，肿瘤的形成是一个复杂的过程，不仅受多种基因的调控，而且与机体内许多生理功能如自噬、凋亡、应激等密切相关。近年来，自噬在肿瘤的发生发展以及术后预后过程中发挥的重要作用受到了高度的关注。自噬是指细胞降解受损细胞器如线粒体、核糖体或细胞内长周期蛋白质的一种重要生理过程，为维持细胞的稳定起着重要的作用。线粒体自噬是自噬的类型之一，可维持线粒体的稳态。自噬在肿瘤中的作用与细胞所处的微环境有关，所处微环境不同自噬在肿瘤细胞中的作用可能完全相反：自噬的抑制不仅会造成细胞DNA稳定性降低，而且可减少非正常细胞的死亡，从而促进肿瘤发生；肿瘤细胞所处环境发生变化时（缺乏营养、缺氧、能量不足等），自噬可调节细胞内细胞器及蛋白的降解速率来维持肿瘤细胞生存。
　　研究发现定位于线粒体内膜的富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白（Leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing protein，LRPPRC）在肺腺癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜腺癌以及淋巴瘤中高表达。它在肿瘤中表达情况与前列腺癌、胃癌、卵巢癌等肿瘤的分级、远处转移相关。更为重要的是，LRPPRC在肿瘤中表达越高，患者术后5年生存率以及10年生存率越低。除了与肿瘤的关系，LRPPRC与自噬也有着密切联系。LRPPRC与自噬重要调节蛋白MAP1S可以形成稳定复合物，并且有学者认为LRPPRC可能参与到了自噬以及线粒体自噬的过程中。
　　本课题研究的目的是明确LRPPRC在自噬过程中发挥的基本生物功能，以及LRPPRC在自噬中的具体调节机制。实验中使用HeLa、COS7、HEK-293T三种细胞系，研究LRPPRC蛋白水平的变化对自噬以及线粒体自噬水平的影响。并且着重分析了LRPPRC对维持线粒体稳定所起的作用、LRPPRC对线粒体自噬调节通路PINK1/Parkin的影响以及LRPPRC在对自噬激活起关键调节作用的PI3K/Akt/mTOR信号通路中的效应。发现LRPPRC作为一种定位在线粒体内膜上的蛋白，能参与自噬以及线粒体自噬调节过程，对维持机体和细胞稳态起重要调节作用。这为以后研究LRPPRC在肿瘤发生发展以及术后预后过程中所起作用的研究提供一定的实验依据和理论基础。
　　第1部分 LRPPRC对基础自噬水平的影响
　　目的：探讨LRPPRC表达水平被下调或上调后对基础自噬水平的影响。
　　方法：筛选并培养稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞（HeLa-GFP-LC3细胞）。在HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3细胞中转染LRPPRC siRAN抑制细胞LRPPRC表达含量，并在COS7细胞中转染入GFP-LRPPRC质粒使细胞内LRPPRC过表达。应用电子显微镜扫描比较转染LRPPRC siRAN与转染Control siRAN的HeLa细胞中的自噬空泡。使用NH4Cl（20nM）或者BAF（10nM）作为溶酶体抑制剂，抑制自噬小体降解。采用免疫印迹、免疫荧光方法检测当细胞LRPPRC蛋白水平改变以及在有或无溶酶体抑制的条件各HeLa、HEK-293T和HeLa-GFP-LC3细胞中自噬标记物LC3、P62、GFP-LC3的表达量和COS7细胞中LC3的蛋白含量。
　　结果：HeLa、HEK-293T、HeLa-GFP-LC3细胞中LRPPRC水平下降均导致细胞内LC3、P62、GFP-LC3蛋白水平降低，且HeLa-GFP-LC3细胞中GFP-LC3荧光点减少。但是在加入溶酶体抑制剂后LRPPRC水平下降导致细胞内LC3、P62、GFP-LC3升高明显且高于LRPPRC表达正常的细胞，GFP-LC3荧光点聚集并呈斑块状也明显多于LRPPRC表达正常的细胞。用电子透射显微镜观察HeLa细胞中自噬相关结构时发现自噬空泡在抑制LRPPRC后下降，但是同时使用溶酶体抑制剂后明显高于LRPPRC未被抑制的细胞。COS7细胞中LRPPRC蛋白水平的增高使细胞内LC3的表达含量增高，但加入溶酶体抑制剂后细胞中LC3的蛋白水平低于LRPPRC表达正常的细胞。
　　结论：LRPPRC被抑制细胞基础自噬水平提高、LRPPRC过表达时基础自噬水平降低。LRPPRC抑制时不仅能通过促进自噬小体的生成，而且可以促进自噬小体的降解速率。
　　第2部分LRPPRC对线粒体自噬的影响
　　目的：研究LRPPRC表达被抑制后细胞中线粒体以及线粒体自噬的改变情况。
　　方法：在HeLa细胞中转染LRPPRC siRAN抑制细胞LRPPRC表达含量。利用Mitotracker对细胞线粒体染色以及免疫荧光对cytochrome c染色的方法比较正常细胞与LRPPRC表达抑制HeLa细胞中线粒体电位情况。使用Tom20标记线粒体，并采用免疫荧光、免疫印迹方法比较有或无溶酶体处理的正常HeLa细胞、LRPPRC表达抑制HeLa细胞中线粒体总量。还应用免疫荧光双染色法对比研究有或无溶酶体处理的HeLa-GFP-LC3细胞、LRPPRC表达抑制的HeLa-GFP-LC3细胞中，Tom20标记的线粒体与LAMP1/2标记的溶酶体或LC3标记的自噬小体的共定位情况。
　　结果：LRPPRC被抑制表达后，HeLa细胞内 Mitotracker荧光减弱、cytochrome c荧光与免疫印迹检测的蛋白含量均下降。未使用溶酶体抑制剂时，LRPPRC抑制细胞中Tom20标记的线粒体与GFP-LC3的共定位、Tom20的总量都比正常细胞少。在使用了溶酶体抑制剂后，LRPPRC被抑制细胞中Tom20标记的线粒体与GFP-LC3的共定位比LRPPRC未被抑制的细胞多，且两种细胞中Tom20的总量相同。在使用了溶酶体抑制剂后，LRPPRC被抑制细胞中Tom20标记的线粒体与LAMP1/2标记的溶酶体或LC3标记的自噬小体的共定位均多于LRPPRC未被抑制的细胞。
　　结论：LRPPRC可以维持线粒体电位稳定，并且抑制LRPPRC的表达导致线粒体自噬的激活。
　　第3部分LRPPRC在线粒体自噬中调节机制的研究
　　目的：研究LRPPRC在线粒体自噬过程中发挥的作用，以及LRPPRC与线粒体自噬调节信号通路PINK1/Parkin间的相互关系。
　　方法：采用CCCP（10μM）或6-OHDA（100μM）处理细胞，建立线粒体自噬的细胞模型。HEK-293T细胞在CCCP或6-OHDA处理后，应用免疫印迹方法检测不同时间点有或无溶酶体抑制剂处理的细胞中自噬相关蛋白ATG5-12、LC3、Bcl-2、P27以及LRPPRC的蛋白水平，并通过电子显微镜观测这些细胞中线粒体的形态与数量。利用免疫共沉淀方法对比检测HEK-293T细胞有或无CCCP处理时细胞中内源性LRPPRC与内源性Parkin的相互关系。并且在HeLa细胞中转染GFP-Parkin质粒后，通过免疫荧光双染法与免疫共沉淀方法对比检测有或无CCCP处理的细胞中内源性LRPPRC与外源性GFP-Parkin的相互关系。在HeLa细胞中过表达RFP-LC3，并筛选稳定表达（HeLa-RFP-LC3）细胞株。为了明确LRPPRC在线粒体自噬中的作用使用CCCP处理转染GFP-Parkin质粒的HeLa-RFP-LC3细胞，采用免疫荧光方法观察不同时间点时细胞内GFP-Parkin、LRPPRC、RFP-LC3、LAMP2标记的溶酶体、Tom20标记的线粒体之间的共定位现象。在HEK-293T细胞中转染Parkin siRNA或HeLa细胞Parkin-GFP质粒，以及在GFP-Parkin质粒转染的HeLa细胞中使用CCCP处理不同时间，用免疫印迹的方法比较HEK-293T细胞、HeLa细胞中Parkin蛋白水平的变化对LRPPRC的影响以及比较表达Parkin-GFP与GFP的HeLa细胞中CCCP处理不同时间后Tom20、LRPPRC蛋白水平的变化。在HeLa细胞中采用转染LRPPRC siRNA，或在COS7细胞中转染GFP-LRPPRC质粒，达到调节细胞中LRPPRC的水平。在过表达GFP-LRPPRC和GFP的细胞（对照细胞）内加入蛋白合成抑制剂CHX，以及在CHX处理不同时间后这两种细胞中Parkin蛋白的变化。同样，使用免疫印迹比较细胞中LRPPRC蛋白水平的变化后在有或无 CCCP处理的细胞中线粒体蛋白 VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20、Parkin蛋白的蛋白含量，并采用免疫荧光的方法观察转染LRPPRC-GFP质粒或GFP质粒的COS7细胞在CCCP处理不同时间点线粒体形态的变化。
　　结果：CCCP或6-OHDA处理HEK-293T细胞后，LRPPRC均在药物作用较长时间24h或12h才开始逐渐降低，Tom20蛋白水平的降低落后于LRPPRC。在CCCP或6-OHDA处理前期ATG5-12、LC3蛋白表达增高，并在加入溶酶体抑制剂后有累积，但在较长时间24h或12h后，ATG5-12、LC3蛋白表达含量在同时加入溶酶体抑制剂后仍不能够增高。细胞中Bcl-2、P27随着药物使用时间延长蛋白水平均下降。电镜下观察HEK-293T细胞在6h时细胞内肿胀细胞增多，48h后即使加入溶酶体抑制剂细胞内仍不能发现完整线粒体。免疫共沉淀实验显示HEK-293T细胞中内源性Parkin与LRPPRC，以及过表达GFP-Parkin质粒的HeLa细胞中外源性Parkin与LRPPRC之间均存在相互结合现象，并且在CCCP处理2.5h后，Parkin与LRPPRC的结合率在两种细胞中均增高。HeLa-RFP-LC3细胞转染GFP-Parkin及GFP质粒后用在CCCP处理不同时间，在12h时Tom20、Parkin标记的线粒体才开始与LC3标记的自噬小体、LAMP2标记的溶酶体有共定位，而这些与LC3、LAMP2结合的线粒体均是有LRPPRC缺失。HEK-293T细胞中Parkin的蛋白水平变化对LRPPRC没有影响，HeLa细胞中过表达GFP-Parkin也不影响LRPPRC的蛋白水平。但HeLa细胞中过表达GFP-Parkin使细胞在CCCP的处理下LRPPRC和Tom20蛋白降低速度加快。HEK-293T细胞中LRPPRC被抑制后Parkin蛋白水平下降并且过表达GFP-LRPPRC可以延长COS7细胞中Parkin蛋白半衰期。在有或无使用CCCP处理的条件下LRPPRC降低后均可以促进HEK-293T细胞中Parkin底物VDAC1、MFN-1、Drp1和Tom20蛋白水平降低速度。LRPPRC-GFP过表达的COS7比仅过表达GFP的COS7细胞的Parkin以及Tom20降低速度明显减慢，且免疫荧光显示GFP-LRPPRC表达的COS7细胞中线粒体荧光持续时间比仅表达GFP的细胞长。
　　结论：LRPPRC可以与Parkin相互结合，并且在线粒体自噬中Parkin从细胞胞浆转移到线粒体上后与LRPPRC结合，使得LRPPRC与Parkin结合增多并启动线粒体上相关蛋白通过溶酶体途径降解。LRPPRC可以维持Parkin的稳定性，并且抑制线粒体通过自噬降解。
　　第4部分 LRPPRC对自噬起始信号通路PI3K/Akt/mTOR的调节作用的研究
　　目的：明确LRPPRC与Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII之间的相互关系，以及LRPPRC在PI3K/Akt/mTOR通路激活过程中的作用。
　　方法：在HEK-293T细胞中转染GFP-Parkin和/或转染LRPPRC siRNA后，用免疫印迹方法检测细胞内Bcl-2、LC3的蛋白水平。使用免疫印迹方法检测转入LRPPRC siRNA和/或P27 siRNA、LRPPRC siRNA和/或ATG5 siRNA以及三种 siRNA共同转染的HeLa细胞在有或无使用溶酶体抑制时，LRPPRC、ATG5、P27和LC3的蛋白水平变化。采用免疫印迹方法比较转染LRPPRC siRNA和Control siRNA的HeLa细胞与HEK-293T细胞以及LRPPRC表达高的COS7细胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量。使用免疫共沉淀方法比较 LRPPRC抑制的HeLa细胞与 HEK-293T细胞中Bcl-2、Beclin1、PI3KCIII三种蛋白相互结合情况。
　　结果：LRPPRC表达受抑制时细胞中Bcl-2、LC3蛋白水平均降低，同时过表达Parkin会使原本减低的Bcl-2、LC3蛋白水平有一定程度增高。LRPPRC抑制并加入溶酶体抑制时LC3增多，对细胞中ATG5、P27的蛋白水平无影响。加入溶酶体抑制后，抑制ATG5表达，LC3降低。同时抑制LRPPRC和ATG5的表达后，细胞中LC3也减低。同时抑制LRPPRC、ATG5、P27的表达后，细胞中LC3也减低明显。HeLa细胞与HEK-293T细胞LRPPRC表达抑制后相对于LRPPRC表达正常的细胞，仅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不变。COS7细胞LRPPRC表达增高后，也仅有Bcl-2蛋白含量降低，Beclin1、PI3KCIII的蛋白含量不变。HeLa细胞与HEK-293T细胞中，LRPPRC与Bcl-2、Beclin1结合，不与PI3KCIII结合，并且当LRPPRC被抑制后，LRPPRC Bcl-2、Beclin1结合下降，Bcl-2与Beclin1结合也下降，Beclin1与PI3KCIII结合增高。
　　结论：LRPPRC对自噬的调节需要 ATG5的参与。LRPPRC与 Bcl-2、Beclin1结合形成蛋白复合物，当 LRPPRC被抑制时，LRPPRC与 Bcl-2、Beclin1蛋白复合物稳定性下降，促进了Bcl-2与Beclin1的解离和Beclin1与PI3KCIII的结合，从而通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路提高自噬水平。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 LRPPRC对基础自噬水平的影响

2.1概述

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

第3章LRPPRC对线粒体自噬的影响

3.1概述

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

第4章LRPPRC在线粒体自噬中调节机制的研究

4.1概述

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.5结论

第5章LRPPRC对自噬起始信号通路PI3K/Akt/mTOR的调节作用的研究

5.1概述

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

5.5结论

第6章总结与展望

6.1全文总结

6.2问题与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间研究成果

综述: 自噬与肿瘤