熊果酸对NADPH氧化酶亚基在静止型肝星状细胞活化过程中表达及功能的影响

摘要

背景：
　　肝纤维化由各种慢性肝损伤引起的肝脏过度修复反应造成，主要以I型胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝脏内过度沉积为特征。活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是ECM的主要来源，所以静止型HSC向活化型HSC激活、转化的过程是肝纤维化的中心事件。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）及其产生的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）诱导的氧化应激被证实在HSC的激活、转化及肝纤维化发病及进展中具有十分重要的作用。
　　我们前期研发现中药单体熊果酸能够显著抑制细胞因子瘦素、AngII及PDGF诱导的活化型HSCs内NOX亚基的表达、NOX活性、NOX来源的ROS产生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信号通路的激活，从而抑制活化型HSCs的增殖、并诱导其凋亡，发挥抗肝纤维化作用。那么熊果酸干预是否也能够通过下调NOX的表达而抑制静止型HSC的活化，早期预防肝纤维化的发生，目前尚未阐明。本课题将继续在前期研究的基础上，以健康大鼠原代静止型肝星状细胞为研究对象，以TGF-β为促 HSC活化因子，探讨熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基表达的影响及该影响与静止型HSC激活、转化之间的关系，进一步探讨熊果酸抗肝纤维化的作用机制。
　　目的：
　　探讨熊果酸对大鼠静止型HSC活化过程中NOX亚基表达的影响，及该影响与静止型HSC激活、转化之间的关系。
　　方法：
　　采用肝脏原位灌注及密度梯度离心法从健康SD大鼠体内分离提取原代静止型HSCs，待原代HSCs自然培养至第5天时将细胞随机分成五组并加用不同药物进行处理：空白对照组（control组，细胞自然培养活化），熊果酸组（UA组，40μM），TGF-β组（5μg/L），熊果酸干预组（UA+TGF-β组，UA40μM+TGF-β5μg/L），DPI干预组（DPI+TGF-Β组，DPI10μM+ TGF-β5μg/L）。原代HSCs经加药处理24h后提取细胞总蛋白，Western blot检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特异性标志物α-SMA的蛋白表达水平。药物作用12h后采用RT-qPCR检测NOX亚基Rac1、p22phox及I型胶原的mRNA表达。
　　结果：
　　1熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基蛋白表达的影响
　　1.1 熊果酸对静止型HSC活化过程中gp91phox蛋白表达的影响
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后gp91phox蛋白水平明显高于空白对照组（P<0.01）；熊果酸组NOX亚基gp91phox蛋白表达明显低于空白对照组（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs之前加入熊果酸进行干预后gp91phox蛋白水平较单纯TGF-β刺激组显著降低（P<0.01），并且与NOX抑制剂DPI干预组相比gp91phox蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。上述实验结果表明，静止型HSC活化过程中gp91phox蛋白表达明显升高，而熊果酸干预能够抑制静止型HSC活化过程中NOX亚基gp91phox的蛋白表达。
　　1.2 熊果酸对静止型HSC活化过程中p67phox蛋白表达的影响
　　原代HSCs经TGF-β刺激24h后NOX亚基p67phox蛋白表达显著高于空白对照组（P<0.01）；熊果酸组p67phox蛋白表达则明显低于空白对照组（P<0.05）；用TGF-β刺激原代 HSCs之前加入熊果酸进行干预后p67phox蛋白水平较单纯TGF-β刺激组显著降低（P<0.01），其与NOX抑制剂DPI干预组相比p67phox蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。上述结果表明，静止型HSC活化过程中p67phox蛋白表达明显升高，而熊果酸干预能够有效抑制静止型HSC活化过程中NOX亚基p67phox的蛋白表达。
　　1.3 熊果酸对静止型HSC活化过程中p22phox蛋白表达的影响
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后细胞内p22phox的蛋白表达明显高于空白对照组（P<0.01）；熊果酸组p22phox蛋白表达明显低于空白对照组（P<0.05）；TGF-β作用于原代HSCs前使用熊果酸干预使细胞内p22phox蛋白水平较单纯TGF-β刺激组均显著降低（P<0.01），且与DPI干预组相比无明显统计学差异（P>0.05）。上述结果表明，静止型HSC活化过程中p22phox蛋白表达水平明显升高，而熊果酸干预能够有效抑制静止型HSC活化过程中NOX亚基p22phox的蛋白表达。
　　2.熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基mRNA表达的影响
　　2.1 熊果酸对静止型HSC活化过程中Rac1mRNA表达的影响
　　用TGF-β刺激原代HSCs12h后细胞内Rac1mRNA表达明显高于空白对照组（P<0.01）；熊果酸组原代HSCs内Rac1 mRNA表达则显著低于空白对照组（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs前分别给予熊果酸、DPI干预后Rac1 mRNA表达较单纯TGF-β组均明显降低（均P<0.05），且该两组间Rac1 mRNA表达统计学差异不明显（P>0.05）。上述结果表明，静止型HSC活化过程中Rac1 mRNA表达水平明显升高，而熊果酸干预能够有效抑制静止型HSC活化过程中NOX亚基Rac1的mRNA表达。
　　2.2 熊果酸对静止型HSC活化过程中p22phox mRNA表达的影响
　　TGF-β刺激组原代HSCs内p22phox mRNA表达明显高于空白对照组（P<0.01）；熊果酸组p22phox mRNA表达则明显低于空白对照组（P<0.01）；在TGF-β刺激前给予熊果酸干预p22phox mRNA表达较单纯TGF-β组明显降低（P<0.01），且其效果与NOX抑制剂DPI干预组无明显差异（P>0.05）。上述结果表明，静止型HSC活化过程中p22phox mRNA表达水平明显升高，而熊果酸干预能够有效抑制静止型HSC活化过程中NOX亚基p22phox的mRNA表达。
　　3.熊果酸对静止型HSC活化过程中α-SMA蛋白表达的影响
　　原代HSCs经TGF-β刺激24h后α-SMA蛋白表达明高于空白对照组（P<0.05）；熊果酸作用于自然培养的原代HSCs后α-SMA蛋白表达水平较空白对照组明显降低（P<0.05）；在TGF-β刺激前分别使用熊果酸、NOX抑制剂DPI进行干预后α-SMA蛋白的表达较单纯TGF-β刺激组均显著下降（均P<0.01），较空白对照也均明显下降（均P<0.05），且两组间α-SMA的表达无明显统计学差异（P>0.05）。上述结果表明，NOX参与诱导HSC的活化，熊果酸干预能够有效降低静止型HSC活化过程中α-SMA的蛋白表达，抑制静止型HSC的活化。
　　4.熊果酸对静止型HSC活化过程中I型胶原mRNA表达的影响
　　TGF-β刺激原代HSCs12h后I型胶原mRNA表达则明显高于空白对照组（P<0.05）；熊果酸组 I型胶原mRNA表达明显低于空白对照组（P<0.05）；在TGF-β刺激前分别给予熊果酸、DPI干预后I型胶原mRNA表达较单纯TGF-β刺激组均明显降低（均 P<0.01），两组间 I型胶原mRNA表达无明显差异（P>0.05）。上述结果表明，NOX参与调控HSC合成I型胶原，熊果酸干预能够有效降低静止型HSC活化过程中I型胶原的mRNA表达。
　　结论：
　　1．在静止型HSC活化过程中NOX亚基gp91phox、p67phox、p22phox、Rac1的蛋白及mRNA表达明显升高，熊果酸干预能够抑制NOX亚基的表达上调。
　　2.NOX参与调控静止型HSC的活化及HSC内胶原合成，熊果酸干预能有效抑制静止型HSC活化及HSC内胶原合成，其机制可能与熊果酸抑制HSC活化过程中NOX亚基的表达有关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 研究方法

2.3 统计学处理

第3章 结果

3.1 大鼠原代HSC活性、纯度、静息及活化状态的鉴定

3.2熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基gp91phox、p67phox及p22phox蛋白表达的影响

3.3熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基Rac1及p22phox mRNA表达的影响

3.4 熊果酸对静止型HSC活化过程中α-SMA表达的影响

3.5 熊果酸对静止型HSC活化过程中I型胶原mRNA表达的影响

第4章 讨论

4.1 NADPH氧化酶在静止型HSC活化中的作用

4.2 熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基表达的影响

4.3 熊果酸对静止型HSC活化过程中a-SMA表达的影响

4.4 熊果酸对静止型HSC活化过程中I型胶原合成的影响

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综 述(一): AngII及其受体AT1R与肝纤维化的相关性

综 述(二): NADPH氧化酶家族成员促肝纤维化的研究进展