慢病毒介导的TACO基因特异性siRNA对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影响及其相关机制研究

摘要

目的：构建可表达TACO基因特异性siRNA的慢病毒干涉载体，在此基础上探讨TACO对巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌的影响及相关机制，为后续活体内靶向性抗Mtb感染的研究提供方向和基础。
　　方法：⑴根据TACO基因的mRNA序列选择3条靶序列，遵照siRNA设计原则设计相应的shRNA,同时设计一条碱基序列被随机打乱的序列作为对照shRNA序列。针对各shRNA分别设计一对单链寡聚脱氧核苷酸，经退火形成相应shRNA表达的双链DNA片段，再通过切分子克隆的方法将其插入shRNA慢病毒表达框架质粒pSicoR，获取四个重组慢病毒表达载体pSicoR-TACO-siRNA。经酶切及测序鉴定无误后，将其分别命名为pSRT1-4，其中pSRT4为含对照shRNA表达序列的慢病毒表达质粒。⑵将重组慢病毒干涉载体（pSRT1-4）同膜蛋白质粒pMD2G与慢病毒包装质粒pSPAX2按一定比例混合包装病毒颗粒，收集可表达相应shRNA的病毒颗粒（分别命名为LV-pSRT1-4）。收集的慢病毒颗粒采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩，再用逐孔倍比稀释法感染293T细胞，通过检测荧光表达细胞个数，进行病毒滴度计算。将包装后的慢病毒以一定比例感染RAW264.7细胞，48h后裂解细胞提取细胞总RNA进行荧光定量PCR检测巨噬细胞内TACO基因转录水平表达情况。再将经慢病毒感染72h的RAW264.7细胞裂解提取细胞总蛋白进行Western Blot蛋白印迹法，检测巨噬细胞内TACO蛋白的表达情况，筛选干扰效果最佳的重组慢病毒干涉载体。⑶分别用LV-pSRT1和LV-pSRT4感染RAW264.7细胞，72h后采用Mtb H37Rv分别对这些细胞进行感染，于感染4h后洗去细胞外未被吞噬的细菌并以此时间点计为0h。细胞分别于Mtb感染后0h、24h、48h和72h采用1％triton进行裂解，释放出未杀灭的细菌，经稀释后均匀涂布于M7H10平板，待菌落生长后进行计数，并统计比较各组差异。⑷采用Alexa Fluor?647染料对MTB H37Rv进行染色，用此染色后的MTB分别对未感染或经LV-pSRT1或LV-pSRT4感染后的RAW264.7细胞进行感染，24h后，采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Mtb与溶酶体的共定位情况，探讨下调TACO表达对MTB吞噬体与溶酶体融合率的影响。⑸分别用LV-pSRT1和LV-pSRT4对巨噬细胞进行感染，72h后再用MTB H37Rv按MOI=5:1的比例对这些巨噬细胞进行感染，同时设置不用MTB感染的对照组。24h后，裂解各组细胞，采用western-blot法检测LC3的表达水平，评价下调TACO表达对巨噬细胞自噬水平的影响。
　　结果：①酶切和测序结果显示，TACO特异性 siRNA慢病毒干涉载体PSRT1,PSRT2，PSRT3及对照序列慢病毒干涉载体PSRT4构建成功。②将包装、浓缩后的慢病毒感染293T细胞24h后即可检测90%荧光，经病毒滴度检测其滴度均可达1~2×108 TU/mL以上，符合转染所需病毒滴度。慢病毒感染巨噬细胞48h后荧光表达率可高达90%。③荧光定量PCR结果显示LV-pSRT1，LV-pSRT2，LV-pSRT3对RAW264.7细胞TACO mRNA的抑制率分别为85.24%，80.71%和42.49%，抑制效果最强的为PSRT1。Western Blot免疫印迹结果同荧光定量PCR结果一致，根据其灰度扫描，LV-pSRT1，LV-pSRT2，LV-pSRT3感染组RAW264.7细胞的TACO相对表达量分别为0.31，0.38，0.47。④荷菌量的结果显示，LV-pSRT1可显著促进巨噬细胞对MTB的杀伤能力。与LV-pSRT4感染组比较，LV-pSRT1对巨噬细胞内MTB存活的相对抑制率在24h、48h和72h时分别为47.26%、53.00%、63.92%。⑤与LV-pSRT4相比，LV-pSRT1感染可显著提高RAW264.7细胞内MTB与溶酶体的共定位率（75.67% vs Con组：9.33%），提示下调TACO的表达可显著增强MTB吞噬体与溶酶体的融合率。⑥Western Blot检测结果显示，LV-pSRT1感染对RAW264.7细胞LC3的表达以及LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均无明显影响，提示下调TACO表达对巨噬细胞的自噬水平无明显影响。
　　结论：⑴成功构建了靶向小鼠TACO基因的shRNA的重组慢病毒载体，并通过慢病毒包装成功获取了可表达TACO基因特异性shRNA的慢病毒颗粒。⑵通过实时荧光定量PCR及Western blot检测方法，筛选出TACO-shRNA1(PSRT1)为最有效的干扰序列，为进一步验证其抑菌功能奠定了基础。⑶研究证实PSRT1可显著增强巨噬细胞杀伤胞内MTB的能力。⑷研究发现抑制TACO的表达可有效促进巨噬细胞内含MTB的吞噬体与溶酶体的融合，提示TACO的存在可能是阻碍巨噬细胞内MTB吞噬体成熟的主要机制之一。⑸研究显示抑制TACO的表达对巨噬细胞的自噬水平无明显影响，提示PSRT1促进MTB吞噬体与溶酶体融合的功能并不是通过自噬-溶酶体途径实现的，具体机制有待进一步的研究。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 TACO 慢病毒干涉载体的构建及鉴定

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3讨论

第3章 TACO 慢病毒干涉载体抑菌功能检测及其机制探讨

3.1 概述

3.2材料和方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 总结

4.1概述

4.2 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 结核分枝杆菌感染与自身免疫疾病相互关系的研究进展﹡