人体血浆中miR-148a表达水平与氟伐他汀药代动力学的相关性研究

摘要

背景：
　　微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码单链RNA，约20~24nt，普遍存在于真核生物中。miRNA通过参与基因转录后水平的调控，不仅在细胞分化、增殖、代谢和凋亡等生理病理过程，而且在药物转运代谢的调控中发挥着重要作用。有研究已表明miR-148a可与核受体PXR3’-UTR的miR-148a识别元件（PXR-MRE-148a）结合，进而抑制PXR mRNA的翻译，使得PXR蛋白水平降低，其下游CYP3A4表达量随之减少；证明miRNA可通过对靶基因mRNA的转录后调控，引起PXR的翻译抑制，最终减少其下游靶蛋白的表达。本课题组前期研究也发现，同样作为PXR下游靶基因的OATP1B1的活性随着PXR表达的增加而升高且PXR的表达量受miR-148a转录后调控的影响，即miR-148a确能够基于PXR介导调控OATP1B1的表达。那么国人血浆中miR-148a的分布是否存在差异？若有，此种差异与OATP1B1底物氟伐他汀体内药代动力学过程是否有关联？确值得我们深入研究，以期为他汀类药物显著的个体差异提供新的理论依据。
　　目的：
　　1.探明人血浆中miR-148a的分布情况；
　　2.探明人血浆中 miR-148a的表达水平与氟伐他汀主要药代动力学参数之间的关联，以期揭示miR-148a对人体内氟伐他汀药代动力学的确切影响。
　　方法：
　　1.建立人血浆中miR-148a表达水平的RT-qPCR检测方法；
　　2.按临床试验方案，招募健康受试者、采集血浆样本并以 RT-qPCR测定miR-148a的表达水平；以Shapiro-Wilk test对所得实验数据进行正态性检验，按血浆中 miR-148a表达水平进行四分位数分组，考察组间差异，探明人血浆中miR-148a的分布情况；
　　3.建立人血浆中氟伐他汀LC-MS/MS检测方法；
　　4.筛选血浆中miR-148a高表达（△Ct值小于第一四分位数）和低表达（△Ct值大于第三四分位数）的受试者各8人入组氟伐他汀人体药代动力学研究；单剂量口服给药氟伐他汀40mg，LC-MS/MS法测定不同时刻（0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12h）血药浓度并绘制药-时曲线；采用DAS2.1求算主要药代动力学参数（AUC0-12、AUC0-∞、Cmax、Tmax、CL、Vd、t1/2），比较miR-148a高、低表达组间氟伐他汀药代动力学特征的差异，揭示人血浆中miR-148a的表达水平与氟伐他汀药代动力学的相关性。
　　5.数据处理与统计分析：实验组的数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用SPSS13.0统计软件进行两独立样本t检验，P<0.05的实验结果表明差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.建立了稳定的血浆中 miR-148a表达水平的测定方法：同一样本批内重复性检验结果分别为9.51±0.11、8.85±0.24和0.74±0.07；批间重复性检验结果分别是9.90±0.51，8.90±0.91和0.79±0.10，RSD在±15％以内，符合要求。
　　2. Shapiro-Wilk检验得statistic=0.98，sig=0.17，P>0.05，即77例健康受试者血浆中 miR-148a表达水平呈正态分布；按四分位数分组，各组 miR-148a表达水平分别是1.34±0.78，3.70±0.77，5.69±0.66和8.33±1.27，Dunnett’s T3法检验显示各组间差异具有统计学意义（p<0.01），提示人体血浆中 miR-148a的表达水平存在差异。
　　3.建立了血浆中氟伐他汀 LC-MS/MS检测方法：标准曲线方程为y=0.0320x+0.0066（r=0.9960），线性范围为0.5-500 ng·mL-1，定量下限为0.5 ng·mL-1；低、中、高三种浓度（1.2，50，400 ng·mL-1）的氟伐他汀批内精密度分别是1.17±0.16、49.08±3.68和420.63±17.93 ng·mL-1，批间精密度分别为1.12±0.15，48.76±3.91和411.24±15.23 ng·mL-1，RSD均符合要求（高浓度在±15%以内，低浓度在±20%以内）；提取回收率分别为81.40±7.14，75.38±4.48，74.73±1.86，都在66%以上；介质效应及其稳定性考察均与生物样本的测定要求一致。
　　4.筛选出的高、低表达组中 miR-148a表达水平分别为0.51±0.38和8.13±0.85，差异有统计学意义（p<0.01）；DAS2.1求算出miR-148a高、低表达组的主要药代动力学参数并比较：AUC0-12分别775.61±136.59、520.53±122.11 ng·h·mL-1，高表达组明显高于低表达组，P<0.01，差异有统计学意义；AUC0-∞分别为779.88±137.90、524.43±121.64 ng·h·mL-1，高表达组明显高于低表达组，P<0.01，差异有统计学意义；Cmax分别为727.56±150.61、457.86±103.56 ng·mL-1，高表达组明显高于低表达组，P<0.01，差异有统计学意义；Vd分别为185.29±70.06、317.12±93.08 L，高表达组明显低于低表达组，P<0.01，差异有统计学意义；CL分别为52.81±9.92、79.48±16.25 L·h-1，高表达组明显低于低表达组，P<0.01，差异有统计学意义；Tmax分别为0.47±0.21、0.5±0.13 h， P>0.05，差异无统计学意义；t1/2分别为2.55±1.13、2.75±0.65 h，P>0.05，差异无统计学意义。
　　结论：
　　1. miR-148a在人血浆中的表达呈正态分布，且存在较大的个体间差异。
　　2.人血浆中miR-148a的表达水平与氟伐他汀药代动力学过程确有相关性， miR-148a高表达组的 AUC0-12、AUC0-∞、Cmax明显高于低表达组，而 CL、Vd低于低表达组，而Tmax、t1/2未见明显差异。提示miR-148a有可能成为影响氟伐他汀体内药代动力学过程和调脂疗效的另一关键因子。

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 概述

第2章 miR-148a在健康受试者血浆中的分布研究

2.1 材料

2.1.1 人血浆样品

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 建立人血浆中miR-148a表达水平的测定方法

2.2.2健康受试者的招募

2.2.3 健康受试者血浆中miR-148a表达水平的测定

2.2.4 数据处理与统计分析

2.3 结果

2.3.1 人血浆中miR-148a测定方法的评价

2.3.2健康受试者血浆中miR-148a表达水平的分布情况

2.4 讨论

第3章 健康受试者血浆中miR-148a与氟伐他汀药代动力学的相关性研究

3.1材料

3.1.1 主要药品

3.1.2 主要试剂甲醇

3.1.3 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 建立人血浆中氟伐他汀LC-MS/MS检测方法

3.2.2 血浆中miR-148a高、低表达组受试者的筛选

3.2.3 氟伐他汀药代动力学试验给药方案

3.2.4 血样的采集及处理

3.2.5 临床观察

3.2.6 血浆样品的测定

3.2.7 数据处理与统计分析

3.3 结果

3.3.1 氟伐他汀LC-MS/MS方法学评价

3.3.2 血浆中miR-148a高、低表达组受试者的筛选结果

3.3.3 miR-148a高、低表达组受试者血浆中氟伐他汀的测定结果

3.3.4 miR-148a高、低表达组受试者血浆中氟伐他汀的主要药动学参数

3.4讨论

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 循环中microRNAs/miRNAs作为消化系恶性肿瘤和高脂血症生物标记物的研究进展