HMGB1/TLR4信号通路在DSS诱导的小鼠结肠炎中作用及EP对其干预研究

摘要

背景与目的： 炎症性肠病（informatory bowel diseas,IBD）是一类病因尚不十分明确的肠道组织非特异性的慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）与克罗恩病（Crohn’s disease, CD）两大类。目前，大多数学者认为其发病主要由环境因素、遗传因素、感染因素及免疫功能异常等诸多因素共同作用所致。其中，免疫功能异常在 IBD肠道组织炎症的发生、发展与持续中发挥至关重要作用。已明确，Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）是机体识别肠道病原微生物感染、炎症或损伤等释放的危险信号，介导固有免疫应答及诱导适应性免疫应答的一种重要模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR），在IBD肠道组织炎症反应中的作用备受关注，但其作用机制及调控方式尚待进一步研究。近年来研究发现，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box1, HMGB1）既是一种重要的晚期炎症介质，参与许多慢性炎症性疾病及自身免疫性疾病的发生、发展及转归；又是TLR4关键的内源性配体之一，在TLR4信号通路介导的炎症与免疫反应异常中起重要的调控作用。有报道，HMGB1可能在IBD的发生、发展中发挥作用。但其究竟起何作用、调控HMGB1能否改善IBD的肠道慢性炎症反应呢目前国内外鲜有报道。为阐明这一问题，本文构建葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导实验性结肠炎小鼠模型初步探讨HMGB1/TLR4信号通路激活与IBD的关系，并采用HMGB1抑制剂-丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate, EP）进行干预研究，以证实HMGB1在IBD肠道炎症反应中的作用及其可能作用机制。为进一步阐明HMGB1/TLR4信号通路在IBD的作用及以HMGB1为新靶标用于防治IBD提供重要的理论与实验依据。 方法: 1.实验分组： 36只清洁级6～8周龄的BALB/c小鼠，雌雄各半，随机分为3组：①正常对照组（12只）；②DSS模型组（12只）；③DSS+EP组（12只）。 2.构建DSS诱导的IBD小鼠模型，并进行EP干预处理： （1）构建及鉴定 DSS诱导的 IBD小鼠模型：DSS模型组及 DSS+EP组BALB/c小鼠均给予连续饮用5%DSS液7天，建立小鼠急性结肠炎模型。模型建立达标的指标：造模小鼠出现体重下降、腹泻、大便隐血试验阳性或肉眼血便中的任何一种症状。而正常对照组小鼠仅给予饮用水7天。7天后处死小鼠，收集相应的组织标本进行检测。 （2）EP干预处理：于造模第3天起，DSS+EP组小鼠腹腔注射EP（40mg/kg，溶于林格氏液），每日1次，连续5天；而正常对照组及DSS模型组小鼠腹腔注射等量不含EP的林格氏液，每日1次，连续5天。 3.各项小鼠指标的观察与检测： ①每天观察各组小鼠体重与疾病活动指数DAI的改变； ②观察小鼠结肠大体形态上的改变，HE染色方法观察小鼠的结肠病理组织学的变化； ③用免疫组化法来检测小鼠结肠组织HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB p65 p65和Foxp3蛋白的表达。 结果： （1）各组小鼠体重与DAI积分的改变 ①正常对照组小鼠体重呈现出持续上升的状态；DSS模型组小鼠体重呈逐渐下降状态，在造模的第7天下降至最低点；DSS+EP组小鼠造模后体重逐渐下降，第5天下降至最低点，而随后逐渐回升。在实验第5、7天 DSS模型组和DSS+EP组小鼠体重下降百分比均明显高于正常对照组（P<0.01）；在实验第5天，DSS+EP组小鼠体重下降百分比高于DSS模型组（P<0.01），直至实验第7天DSS+EP组小鼠体重下降百分比才低于DSS模型组（P<0.01）。 ②各组小鼠DAI积分改变：在实验第5、7天，DSS模型组和DSS+EP组小鼠的DAI积分均明显高于正常对照组（P<0.01），但DSS+EP组的DAI积分均明显低于DSS模型组（P<0.01)。 （2）小鼠的结肠组织病理学改变 ①小鼠肠黏膜组织的大体形态：正常对照组小鼠的结肠黏膜组织未出现充血、出血、糜烂与溃疡；DSS模型组小鼠可见到结肠黏膜组织有明显充血、出血、糜烂，严重甚至可看到溃疡；但 DSS+EP组结肠黏膜充血、出血和糜烂较DSS模型组稍有减轻。 ② HE染色法观察各组小鼠肠道病理组织学变化， DSS模型组小鼠和DSS+EP组小鼠结肠炎症程度、隐窝破坏程度和病变深度均明显高于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠炎症程度、隐窝破坏程度和病变深度均低于DSS模型组(P<0.01)。 （3）小鼠结肠黏膜Foxp3表达 DSS模型组及DSS+EP组小鼠结肠黏膜Foxp3蛋白表达均明显低于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠黏膜Foxp3蛋白表达高于DSS模型组(P<0.01)。 （4）小鼠结肠黏膜HMGB1表达 DSS模型组及DSS+EP组小鼠结肠黏膜HMGB1蛋白表达均明显高于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠黏膜HMGB1蛋白表达低于DSS模型组(P<0.01)。 （5）小鼠结肠黏膜TLR4表达 DSS模型组及DSS+EP组小鼠结肠黏膜TLR4蛋白表达均明显高于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠黏膜TLR4蛋白表达低于DSS模型组(P<0.01)。 （6）小鼠结肠黏膜MyD88表达 DSS模型组及DSS+EP组小鼠结肠黏膜MyD88蛋白表达均明显高于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠黏膜MyD88蛋白表达低于DSS模型组(P<0.01)。 （7）小鼠结肠黏膜NF-κB p65表达 DSS模型组及DSS+EP组小鼠结肠黏膜NF-κB p65蛋白表达都明显高于正常对照组（P<0.01）；但DSS+EP组小鼠结肠黏膜NF-κB p65蛋白表达低于DSS模型组(P<0.01)。 结论： 1.本研究成功建立了 DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型。EP干预后小鼠肠道炎症减轻，提示EP可以缓解炎症反应，对IBD具有一定的治疗作用。 2.EP干预后，实验性结肠炎小鼠肠黏膜中 Foxp3蛋白表达增加，提示提示EP可能通过调控Foxp3+细胞反应缓解肠道炎症反应。 3. EP干预后，实验性结肠炎小鼠肠黏膜中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达下降，提示EP可能通过抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路的激活缓解肠道炎症反应。

目录

声明

中英缩略词表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2.1 材料和方法

2.1 .1材料

2.1.2方法

2.1.3 统计学方法处理

第3章 结果

3.1 各组小鼠体重变化和DAI积分

3.2各组小鼠肠黏膜大体形态的改变

3.3各组小鼠结肠组织病理的改变

3.4 免疫组化法检测小鼠结肠黏膜Foxp3蛋白表达的变化

3.5免疫组化法检测小鼠结肠黏膜HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达的变化

3.5.1 小鼠结肠黏膜HMGB1蛋白表达的变化

3.5.2 小鼠结肠黏膜TLR4蛋白表达的变化

3.5.3 小鼠结肠黏膜MyD88蛋白表达的变化

3.5.4小鼠结肠黏膜NF-κB p65蛋白表达的变化

第4章 讨论

4.1 DSS诱导小鼠实验性结肠炎模型的构建

4.2 EP干预对实验小鼠体重、DAI积分及组织病理学变化的影响

4.3 EP干预对实验小鼠肠黏膜中Foxp3蛋白表达的影响

4.4 EP干预对实验小鼠肠黏膜中HMGB1、TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达的影响

第5章 结论

参考文献

致谢

综述:T辅助细胞在炎症性肠病免疫机制中的作用