HMGB1/TLR4信号通路在小鼠TNBS结肠炎中的作用及EP对其干预研究

摘要

背景和目的： 炎症性肠病（informatory bowel disease,IBD）,指克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC），是一组病因及其发病机制尚不明确、反复发作并累及到胃肠道的非特异性炎症性疾病[1-4]，其中肠黏膜的异常免疫调节是导致IBD发生的重要原因。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box1,HMGB1）作为一种细胞促炎因子，在多种慢性炎症性疾病的发生与发展中扮演重要角色。现已明确，Toll样受体4（Toll-like receptor4,TLR4）主要通过识别革兰氏阴性菌的脂多糖成分而产生免疫应答，是一种重要的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR），是HMGB1的主要受体之一，研究表明HMGB1/TLR4参与了IBD的发生发展。丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate,EP）可抑制HMGB1合成和释放，是一强有力的抑炎物质。那么EP能否减轻肠道慢性炎症反应？HMGB1/TLR4信号通路在其中起何作用？目前国内外相关报道较少。为此，本研究拟验证EP对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的实验性结肠炎的作用，及其与HMGB1/TLR4信号通路的关系，为以HMGB1为新的治疗靶点，给防治IBD提供相关依据。 方法: 1.实验分组： 选取36只清洁级、6～8周龄的BALB/C小鼠，雌雄各半，随机分为3组： 1)正常对照组（12只）； 2)TNBS模型组（12只）； 3)TNBS+EP组（12只）。 2.构建TNBS诱导的IBD小鼠模型，并进行EP干预处理： （1）构建TNBS诱导的IBD小鼠模型：TNBS诱导小鼠炎症性肠病模型的建立：清洁级BALB/C小鼠先禁食不禁饮1天后，用3.5F导管从肛门插入肠道深约3.5cm，灌注2%TNBS/50%乙醇溶液100μl，将小鼠倒立60秒。 （2）EP干预处理：于造模第3天起，TNBS+EP组小鼠腹腔注射EP（40mg/kg，溶于林格氏液），正常对照组及TNBS模型组注射等量林格氏液，每日1次。 3.观察与检测小鼠的各项指标： ①每天观察各组小鼠的疾病活动指数DAI的改变； ②HE染色观察小鼠的结肠病理组织学的变化； ③检测各组小鼠结肠组织HMGB1、MyD88、NF-κB p65、Foxp3和TLR4蛋白的表达。 ④检测各组小鼠血清中，细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平。 结果： （1）各组小鼠DAI积分的改变：实验第5、7天，TNBS模型组和TNBS+EP组小鼠的DAI积分与正常对照组相比，均明显升高（P<0.01），但TNBS+EP组的DAI积分均明显低于TNBS模型组（P<0.01)。 （2）HE染色法观察各组小鼠的结肠组织病理学改变：TNBS模型组小鼠和TNBS+EP组小鼠得结肠炎症程度、隐窝破坏程度和病变深度均明显高于正常对照组（P<0.01）；TNBS+EP组小鼠的结肠炎症程度、隐窝破坏程度和病变深度均低于TNBS模型组(P<0.01)。 （3）小鼠结肠组织Foxp3、HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白的表达 ①小鼠结肠黏膜Foxp3表达 TNBS模型组及TNBS+EP组小鼠结肠黏膜Foxp3蛋白表达均明显低于正常对照组（P<0.01）；TNBS+EP组Foxp3蛋白表达高于TNBS模型组(P<0.01)。 ②小鼠结肠黏膜HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65表达 TNBS模型组及TNBS+EP组小鼠结肠黏膜HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达均明显高于正常对照组（P<0.01）；TNBS+EP组小鼠结肠黏膜HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达低于TNBS模型组(P<0.01)。 (4)用多重磁珠酶免分析法检测小鼠血清中细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。 ①小鼠血清IL-10的变化 TNBS模型组及TNBS+EP组小鼠血清IL-10水平都明显低于正常对照组（P<0.01）；TNBS+EP组小鼠血清IL-10水平高于TNBS模型组(P<0.01)。 ②小鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α的变化 TNBS模型组及TNBS+EP组小鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α水平都明显高于正常对照组（P<0.01）；TNBS+EP组小鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于TNBS模型组(P<0.01)。 结论： 1.EP可减轻TNBS诱导的小鼠结肠炎有肠道炎症和黏膜损伤，对IBD具有一定的治疗作用。 2.EP可增加TNBS诱导的小鼠结肠炎肠黏膜中Treg细胞，这可能是其减轻肠道炎症机制之一。 3.EP可抑制TNBS诱导的小鼠结肠炎肠黏膜中HMGB1/TLR4信号通路，降低促炎因子水平，上调抑炎因子水平，这可能是其减轻肠道炎症的又一机制。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3 统计学方法处理

第3章 结果

3.1 实验小鼠体重变化和DAI积分

3.2小鼠结肠长度变化

3.3小鼠结肠组织病理的改变

3.4 免疫组化法检测小鼠结肠黏膜Foxp3蛋白表达的变化

3.5免疫组化法检测小鼠结肠黏膜HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达的变化

3.6 用多重磁珠酶免分析法检测小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平

第4章 讨论

4.1 TNBS诱导小鼠实验性结肠炎模型的构建

4.2 EP对小鼠体重、DAI积分及组织病理学的影响

4.3 EP对小鼠肠黏膜中Foxp3蛋白表达的影响

4.4 EP对小鼠肠黏膜中HMGB1、TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达的影响

4.5 EP对细胞因子IFN-α、IL-1β、IL-6、TNF-γ和IL-10的影响

第5章 结论

致谢

参考文献

综述:辅助性T细胞及相关细胞因子与炎症性肠病的关系