草鱼ADAR1 (adenosine deaminase acting on RNA 1)及其剪接异构体ADAR1-like的转录调控分析

摘要

ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA1)是一种经典的干扰素效应蛋白，能通过A-to-I编辑功能对外源病毒dsRNA进行编辑，从而发挥抗病毒功能。此外，作为一种 dsRNA结合蛋白，ADAR1还能通过与病毒或细胞内的其它dsRNA结合蛋白相互作用参与先天免疫等多种生理反应。哺乳类ADAR1有许多剪接异构体，目前研究较多的为p150和p110。p150蛋白是全长ADAR1，而p110蛋白缺少一个Z-DNA结合域(Zα)，它们是由各自的启动子启动转录。实验室前期克隆和鉴定了草鱼 ADAR1两个剪接异构体基因及其基因组序列并分别命名为CiADAR1和CiADAR1-like。研究发现，两者在poly I:C刺激下都有不同程度的表达上调，说明CiADAR1和CiADAR1-like都可能参与了细胞的抗病毒反应。
　　为了进一步明确 CiADAR1和 CiADAR1-like的基因组排布，我们确定了CiADAR1、CiADAR1-like各自的转录起始位点(TSS)，证实 CiADAR1和CiADAR1-like是由不同的启动子启动转录，且有着不同的第一个外显子，其大小分别为78bp和297bp。CiADAR1和CiADAR1-like共用第二个外显子上的翻译起始位点(TIS)，不过由于选择性剪接引起CiADAR1-like蛋白翻译提前终止，最终导致CiADAR1和CiADAR1-like的蛋白结构在N端完全一致，只在C端脱氨酶区域上存在差异。
　　为研究草鱼 ADAR1及其剪接异构体转录调控的分子机制，我们克隆了长度分别为1080bp、1173bp的CiADAR1、CiADAR1-like启动子片段。启动子在线软件分析表明CiADAR1启动子有一个典型的TATA盒且可以分为两个区域，靠近转录起始位点有3个干扰素调节因子结合元件(IRF-E)的近端区域(Pp)和只有1个IRF-E的远端区域(Pd)；CiADAR1-like启动子上含有8个IRF-E元件和3个干扰素刺激应答元件(ISRE)。提示CiADAR1及其异构体基因可能受到IRF的调控。
　　为研究 IRF与 CiADAR1的亲和性，我们表达并纯化了 CiIRF1和 CiIRF3蛋白。体外凝胶阻滞实验结果显示CiIRF1和CiIRF3对CiADAR1、CiADAR1-like启动子片段的迁移速度均有明显的阻滞效果，说明 CiIRF1和 CiIRF3都是CiADAR1、CiADAR1-like潜在的转录调控因子。为了在体内分析 CiIRF1和CiIRF3对CiADAR1、CiADAR1-like的转录调控，构建了CiADAR1、CiADAR1-like启动子荧光素酶报告基因重组质粒 pGL3-ADAR1pro/pGL3-ADAR1Pf、pGL3-ADAR1-likepro分别与真核表达质粒 pcDNA3.1-IRF1、pcDNA3.1-IRF3瞬时共转染至草鱼肾细胞(CIK细胞)，双荧光素酶报告系统结果表明CiIRF1和CiIRF3都能显著提高荧光素酶活性，证实 CiIRF1和 CiIRF3都能够激活CiADAR1、CiADAR1-like转录。
　　为了更进一步探究CiADAR1启动子近端区域和远端区域对CiADAR1转录调控的影响，我们又构建了CiADAR1近端区域和远端区域荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-ADAR1Pp、pGL3-ADAR1Pd并分别与pcDNA3.1-IRF1真核表达质粒瞬时共转染至CIK细胞，双荧光素酶报告基因系统检测荧光信号，结果表明，CiADAR1启动子的近端区域在CiADAR1的转录调控中发挥主要作用。

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第一章 前 言

1.1 ADAR1基因

1.2 ADAR1的结构特征

1.2.1 Z-DNA结合区域(Zα, Zβ)

1.2.2 双链RNA结合区域(dsRBM)

1.2.3 脱氨酶催化区域(Deaminase)

1.3 ADAR1的生物学功能

1.3.1 ADAR1与神经系统

1.3.2 ADAR1与胚胎发育

1.3.3 ADAR1与病毒感染

1.3.4 ADAR1与人类疾病

1.4 鱼类ADAR1研究进展

1.5 研究目的及意义

第二章 材料和方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 主要仪器设备

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要试剂盒

2.1.4 细胞、菌种与载体

2.1.5 引物表

2.2 相关软件

2.3 实验方法

2.3.1 草鱼ADAR1、ADAR1-like转录起始位点的确定

2.3.2 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子的克隆及其报告载体的构建

2.3.3 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子与草鱼IRFs的亲和性分析

2.3.4 草鱼ADAR1、ADAR1-like的转录调控分析

第三章 结果与分析

3.1 草鱼ADAR1、ADAR1-like转录起始位点的确定

3.1.1 草鱼肾细胞(CIK细胞)总RNA的提取

3.1.2草鱼ADAR1、ADAR1-likecDNA 5’末端序列的获得

3.2 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子的克隆及其报告载体的构建

3.2.1 草鱼肾细胞(CIK细胞)基因组DNA的提取

3.2.2 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子的克隆

3.2.3 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子荧光素酶报告基因载体的构建

3.3 草鱼ADAR1、ADAR1-like启动子与草鱼IRFs的亲和性分析

3.4 草鱼ADAR1、ADAR1-like的转录调控分析

3.4.1 草鱼IRFs对草鱼ADAR1、ADAR1-like的转录调控分析

3.4.2 草鱼ADAR1启动子近端和远端区域对草鱼ADAR1转录调控的影响

第四章 讨 论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间的研究成果