C57BL/6小鼠EAE模型CNS中IBA1、IL-10及IL-1β的动态表达及其发病机制的探讨

摘要

目的：
　　建立MOG35-55的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（ Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）模型，检测其发病早期（第7天），发病高峰期（第15天）和恢复期（第28天）时脑组织中与免疫调节相关的小胶质细胞（IBA1）、各时期促炎因子（如IL-1β）及抗炎因子（如IL-10）的表达的动态变化，神经功能评分和体重计数变化。本实验初步探讨了EAE脑脊髓组织内的小胶质细胞免疫相关的作用；观察各个发病时期EAE脑组织病理学，免疫学水平的动态变化；进一步探讨EAE的发病机制，为中枢神经系统脱髓鞘疾病的发病机制及寻求新的治疗方法提供进一步的实验依据。
　　方法：
　　1、将30只8周龄（体重15-20g）C57BL/6雌性小鼠随机分成正常对照组和EAE组，其中21只小鼠建立EAE模型，采用第0天皮下注射200ug的MOG混合剂（MOG35-55和CFA在真空中按1:1混合制成混合剂）,分别于第0天和第2天腹腔注射200ng的PTX，正常组9只注射同等计量的PBS。对正常组及免疫后的EAE组的小鼠每天采取神经功能评分和体重的测量。
　　2、分别在免疫后的第5天，第15天和第28天发病阶段取其脑脊髓组织制成连续石蜡切片，并进行HE染色，Luxol Fast Blue-Eosin双染，观察其炎症细胞和髓鞘脱失情况。
　　3、免疫组化法测定脑脊髓组织小胶质细胞标志物（IBA1）、免疫因子白介素因子10（IL-10）、白介素因子（IL-1β）的表达。
　　结果：
　　1、MOG35-55多肽诱导模型C57BL/6小鼠的一般情况及神经功能评分
　　MOG诱导小鼠免疫平均5.02±1.54天烦躁，消瘦，末尾张力消失，随后后肢无力，后肢麻痹等症状。平均临床评分为2.16±1.42分，第15天发病症状呈持续性且最严重，没有显著缓解，为疾病高峰期。症状28天之后稍微降低，但仍然轻度神经功能缺损。实验对照组和对照组中显著体重减轻和行为异常都没有发现。
　　2、组织病理学检测
　　(1)、HE染色显示：早期组的炎症主要累及脑脊髓实质内的小静脉。周围蛛网膜下腔内可见少许量的炎细胞浸润,并常形成小面积的炎性细胞灶。典型的炎性细胞浸润损害出现疾病的高峰期，显示在大脑和脊髓实质和边缘，蛛网膜下腔和小血管充血的侧脑室脉络丛周围，主要单核淋巴细胞浸润，以形成一个“袖套”状变化。也可见延血管分布，呈条索状，表现为小而深染的细胞核。在海马CA3区伴不同程度的神经元椎体细胞缺损丢失。
　　(2)、IFB染色显示：脑白质出现蓝色区域大小不等的片状脱髓鞘区，或空泡变性。脊髓前索及侧索及脑白质内均有片状脱髓鞘区，蓝色髓鞘区域染色变淡，伊红染色呈红色。髓鞘结构松散，崩解，断裂，脱失，脱髓鞘斑块边缘呈参差不齐，结构不清晰。发现早期组和高峰期组脑白质出现大面积髓鞘脱失斑块，晚期组病灶可累及皮层灰质。
　　3、Iba-1、IL-1β、IL-10免疫组化染色
　　(1)、小胶质细胞IBA1、 IL-1β、IL-10发病早期（第5天）活化较少，在脑和脊髓组织的炎性浸润及髓鞘脱失区域周围，可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润及小胶质细胞活化，多数位于小血管周边。
　　(2)、随着疾病进展，发病高峰期（第15天）在血管及炎症细胞，脉络丛旁聚集处可见大量活化小胶质细胞IBA1阳性细胞，且深染增大的细胞体，棘突回缩明显，形态多变。IL-1β、血管旁，蛛网膜下腔都可见弥漫性的表达，分布均匀，强阳性表达，而IL-10则明显减少，甚至消失。
　　(3)、至病情缓解期阶段（第28天），炎症细胞减少，但在脑白质出现大量小胶质细胞IBA1阳性细胞，棘突明显增多，形态规则。同时，可见因子IL-10大量表达， IL-1β表达也相对增多。
　　结论：
　　1、EAE的发病开始至高峰期及缓解期过程中，其脑组织中炎症细胞数量及脱髓鞘程度发生动态演变。
　　2、随着EAE疾病的进展，小胶质细胞IBA1活化，支链状形态通过缩回这些分支朝着超支链或变形虫样形态转变，表明小胶质细胞在EAE的发病过程中的呈现不同的作用，对疾病的进展和恢复具有重要作用。
　　3、在疾病缓解期，可见抗炎因子 IL-10大量表达，与之同时具有促炎效应的IL-1β表达也相对增多，说明脑脊髓组织中IL-1β和IL-10与小胶质细胞之间存在协同的关系参与了神经保护作用。

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中英文缩略词语

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 实验动物

2.3 实验设备

2.4 实验分组

2.5 实验方法

2.5.1 EAE模型的建立

2.5.2 EAE模型的评分和观察

2.5.3取材、标本处理及蜡块切片制作

2.5.4脑脊髓组织HE染色

2.5.5 Luxol Fast Blue–Eosin双染

2.5.6脑脊髓组织免疫组织化学染色（二步法）

2.5.7图片采集与测量

2.5.8数据统计学分析

第3章 结 果

3.1 EAE小鼠模型的神经功能评分和体重变化比较

3.1.1小鼠发病情况的观察

3.2 小鼠病理学检测结果

3.2.1小鼠CNS的HE染色

3.2.2小鼠CNS的LFB-Eosin染色

3.3 免疫组化结果

3.3.1 小鼠CNS的IBA1抗体的免疫组织化学

3.3.2小鼠CNS的IL-10因子抗体的免疫组织化学观察

3.3.3小鼠CNS的IL-1β因子抗体的免疫组织化学

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的研究进展