miR-101调控CRMP4基因启动子甲基化抑制前列腺癌PC3细胞侵袭与转移的研究

摘要

目的：课题组前期研究表明：CRMP4是新的前列腺癌转移抑制基因；miR-101可通过下调EZH2的表达，继而上调CRMP4表达，从而抑制前列腺癌细胞的转移。
　　本研究拟探讨前列腺癌PC3细胞系中miR-101对CRMP4基因启动子区甲基化的调控作用以及miR-101上调CRMP4的表达后是否可抑制其在体外的迁移及侵袭能力。
　　方法：采用构建pre-miRNA-101以及siRNA EZH2质粒，使用Lipofectamine2000分别将和转染入PC3细胞中，同时使用可抑制EZH2组蛋白甲基转移酶活性的3-Deazaneplanocin A(DZNep)处理前列腺癌PC3细胞作为对照，采用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR, MSP)检测 CRMP4基因在前列腺癌PC3细胞中基因启动子甲基化状态的变化。采用划痕实验及transwell评估转染前后的细胞迁移及侵袭能力的改变。
　　结果：构建 pre-miRNA-101以及 siRNA EZH2质粒，使用 Lipofectamine2000分别将其转染入PC3细胞中，转染效率均大于80％，48h后 real-time RT-PCR Pre-miRNA-101组和 siRNA EZH2组结果均显示：前列腺癌PC3细胞实验组和阴性及空白对照组相对比，CRMP4 mRNA的表达水平明显上升（P﹤0.05），EZH2 mRNA的表达水平明显下降（P﹤0.05），而阴性对照组和空白对照组比较 CRMP4、 EZH2的表达量相差不大（P＞0.05），甲基化特异性PCR（MSP）显示：转染pre-miRNA-101以及 siRNA EZH2质粒及DZNEP处理的PC3细胞中CRMP4基因启动子区甲基化程度与对照组细胞相比明显下降（P﹤0.05），而非甲基化程度相差不大（P＞0.05），细胞划痕实验和Transwell显示细胞的迁移和侵袭能力均明显弱于阴性和空白对照组(P<0．05)。
　　结论：
　　（1）miRNA-101表达上调后在前列腺癌PC3细胞中可下调EZH2的表达，从而调控CRMP4基因的DNA甲基化，进而促进CRMP4基因转录，导致CRMP4表达上调。
　　（2）miRNA-101可通过上调CRMP4的表达抑制前列腺癌PC3细胞的侵袭与转移。