吴茱萸次碱抑制Ox-LDL诱导的Cx43表达上调和血管平滑肌细胞的增殖

摘要

目的：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）斑块形成涉及全血管的病变，其中血管平滑肌细胞（VSMC）异常增殖是导致AS血管壁狭窄、痉挛的重要的病理基础。近年来缝隙连接蛋白43（connexin43, Cx43）在动脉粥样硬化（AS）血管病变中的作用受到了广泛的关注。在整体动物模型发现，AS斑块形成早期Cx43表达升高，并伴有Cx43磷酸化水平改变。本课题在培养的大鼠血管平滑肌细胞上观察Ox-LDL对Cx43表达及磷酸化水平影响的时效和量效关系，并初步探讨其机制。大量研究表明Cx43促进VSMC的增殖，可作为药物调节SMC增殖的重要靶点。吴茱萸次碱（rutaecarpine,Rut）是传统中药吴茱萸主要活性成分，为一种吲哚喹唑啉类生物碱。Rut激活辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)介导心血管保护效应。本课题在Ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖模型进一步研究Rut对Cx43表达和平滑肌细胞增殖的影响，并确定其机制是否涉及TRPV1途径。
　　方法：在培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞株 A7r5，加入不同浓度Ox-LDL(25~100mg/L),Western blot检测Ox-LDL对Cx43蛋白表达和磷酸化水平（ser279/282）的影响，及Ox-LDL处理后不同时间点的Cx43表达变化。预先给予氧自由基清除剂NAC、抗氧化剂PDTC和NF-κb阻断剂BAY11-7082,观察Ox-LDL上调的Cx43表达是否涉及ROS或NF-κb通路。采用Ox-LDL诱导的VSMC增殖模型，预先给予不同浓度的Rut(1×10-6mol/L,3×10-6mol/L,1×10-5 mol/L)处理细胞，并使用TRPV1拮抗剂Capsazepine(1×10-5mol/L)确定Rut的效应是否涉及TRPV1途径。给予GJ通道阻断剂18α-GA，观察阻断GJ对Ox-LDL诱导VSMC增殖的影响。Western blot检测Cx43表达，CCK8检测细胞活力， EdU测定细胞增殖中DNA复制情况，流式细胞仪检测细胞周期，荧光酶标仪检测细胞内ROS的含量。
　　结果：Western blot结果表明不同浓度Ox-LDL（25~100mg/L）均可显著诱导Cx43的表达增加，其中100mg/L最为显著，但各剂量Ox-LDL对Cx43的磷酸化水平的影响均不明显。Ox-LDL诱导的Cx43表达12小时就显著增加，48h最为明显。氧自由基清除剂NAC不能取消Ox-LDL诱导的Cx43表达，而兼有NF-κb抑制作用的抗氧化剂 PDTC和 NF-κb阻断剂 BAY11-7082则可逆转Ox-LDL诱导Cx43表达的作用，提示Ox-LDL这一效应可能与激活NF-κb途径有关，而与氧化应激途径无关联。CCK8，流式检测细胞周期和EdU检测发现Ox-LDL促进血管平滑肌的增殖，GJ阻断剂18α-GA可取消Ox-LDL该作用。预先给予Rut剂量依赖性地抑制Ox-LDL诱导Cx43的表达增加，并抑制VSMC增殖，表现为减少VSMCs数量（CCK），抑制EdU阳性细胞数量，流式细胞周期检测显示Rut可减少VSMCs的增殖期（S期和G2/M）的百分比。预先给予辣椒素受体阻断剂CAPZ可取消Rut这些效应。
　　结论：Ox-LDL可显著升高Cx43的表达水平，但对Cx43的磷酸化无显著影响；Rut可抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞的增殖，该机制与激活TRPV1抑制Cx43表达有关。

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英文缩写及其全称和中文对照表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 主要的材料与试剂

2.1.1 实验用的细胞株

2.1.2 主要的试剂和产品

2.2实验主要仪器和设备

2.3 主要试剂的配制

2.4 实验方法

2.4.1 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞株A7r5的培养

2.4.2 A7r5的AS损伤模型的建立以及实验分组

2.4.3 MTT比色法测定平滑肌细胞增殖情况

2.4.4 EdU试剂盒检测平滑肌细胞复制活性

2.4.5 细胞周期试剂盒测定细胞周期

2.4.6Western blotting法检测A7r5细胞中的Cx43和pCx43蛋白的表达

2.5 数据处理

第3章 实验结果

3.1 Ox-LDL对血管平滑肌细胞中Cx43及细胞增殖的影响

3.1.1Ox-LDL上调A7r5细胞中Cx43表达

3.1.2 Ox-LDL对A7r5中Cx43磷酸化水平的影响

3.1.3 Ox-LDL上调VSMC中Cx43表达的可能机制：氧化应激或NF-κB途径

3.1.4 GJ通道阻断剂18α-GA抑制Ox-LDL诱导的A7r5增殖

3.2 Rut对Ox-LDL诱导的VSMC增殖和Cx43表达的影响

3.2.1 Rut 抑制Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞Cx43的表达上调

3.2.2 Rut抑制Ox-LDL诱导的A7r5细胞增殖

3.2.3 Rut对 Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞DNA复制活性和细胞周期的影响

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1结论

5.2 下一步研究方向

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: Cx43与血管平滑肌研究进展