腺苷A2AR拮抗剂SCH58261对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用研究

摘要

目的：
　　建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain damage, HIBD）模型，研究选择性A2AR拮抗剂SCH58261对短期神经行为学、ICAM-1的表达及细胞凋亡（细胞凋亡指数）的影响，探讨其对新生大鼠HIBD是否存在神经保护作用及合适药物剂量。
　　方法：
　　1.实验分组及模型制作：将40只7日龄新生SD大鼠随机分为5组：Sham组、HIBD组、SCH582610.01 mg/kg组、SCH582610.2 mg/kg组、SCH582612 mg/kg组，每组各8只。参照Rice法建立HIBD模型，Sham组仅分离左颈总动脉，不进行缺氧缺血；HIBD组结扎左颈总动脉，置于8％氧气中缺氧2小时（h）；不同剂量给药组于HIBD造模后即刻腹腔注射SCH582610.01 mg/kg、0.2 mg/kg、2 mg/kg(均溶于0.1 ml DMSO中)，HIBD组给以0.1 ml的DMSO。
　　2.观察指标：各组新生大鼠于HIBD后24h进行神经行为学评定，然后断头处死分别进行HE染色观察脑组织病理改变、免疫组织化学法检测ICAM-1表达、TUNEL法观察细胞凋亡。
　　结果：
　　1.短期神经行为学评定：与Sham组比较，其余4组完成三项神经反射成绩均较差，差异有统计学意义（P<0.05），提示缺氧缺血后短期神经功能受损。与HIBD组相比，三个SCH58261给药组翻正反射、悬崖逃避反射及趋地反射所需时间均缩短（P<0.05）；随着剂量的减低，三项短期感觉运动反射所需时间减少（P<0.05），其中0.01 mg/kg组作用最明显。
　　2.脑组织病理形态学改变：Sham组细胞结构完整，形态正常，边界清楚，核仁清晰。HIBD组脑组织结构紊乱，细胞数明显减少，细胞肿胀、变性，神经元坏死明显。SCH582612mg/kg组可见较多核深染、固缩，与HIBD组相比差异不大；0.2 mg/kg组排列紊乱，可见部分形态正常的细胞，细胞数多于2 mg/kg组；0.01 mg/kg组神经细胞存活数增多，细胞排列尚规则，仅见少许细胞核固缩、碎裂，较0.2 mg/kg组及2 mg/kg组脑组织损伤减轻。
　　3.免疫组化观察ICAM-1的表达：ICAM-1阳性染色呈棕黄色细颗粒沉积，阳性着色于神经元胞浆和胞核内均可见。ICAM-1在Sham组低水平表达，其余4组脑组织中ICAM-1的表达均较Sham组增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与HIBD组相比，三个SCH58261给药组ICAM-1的表达均降低（P<0.05）；随着剂量的减低，ICAM-1的表达逐渐下降（P<0.05），其中0.01 mg/kg组表达最低。
　　4.TUNEL技术检测细胞凋亡：Sham组仅见极少量的TUNEL阳性细胞，其他4组凋亡细胞相对增加，AI较Sham组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与HIBD组相比，三个SCH58261给药组AI降低（P<0.05）；随着剂量的减低， AI逐渐减少（P<0.05），其中0.01 mg/kg组AI最少。
　　5.AI与ICAM-1表达之间的相关性分析：所有模型组（包括HIBD组及三个给药组）脑组织中AI与ICAM-1均呈显著正相关（r1=0.825，P1<0.05；r2=0.937， P2<0.01；r3=0.868，P3<0.01；r4=0.830，P4<0.05），提示随着ICAM-1表达的增加，细胞凋亡增加。
　　6.短期神经行为学评价与 ICAM-1表达的相关性分析：所有模型组（包括HIBD组及三个给药组）翻正反射、悬崖逃避反射、趋地反射与ICAM-1的表达分别呈正相关（r1=0.888，P1<0.01；r2=0.734，P2<0.05；r3=0.863，P3<0.01；r4=0.902， P4<0.01）、（r1=0.766，P1<0.05；r2=0.897，P2<0.01；r3=0.831，P3<0.05；r4=0.769， P4<0.05）、（r1=0.878，P1<0.01；r2=0.817，P2<0.05；r3=0.762，P3<0.05；r4=0.804， P4<0.05），这均提示随着ICAM-1表达的增加，短期感觉运动反射完成时间增加。
　　结论：
　　1.缺氧缺血后新生大鼠出现明显的脑损伤，表现在：脑组织结构紊乱，细胞形态改变如细胞肿胀、变性、坏死，短期神经功能受损，证实新生大鼠HIBD模型建立成功。
　　2.缺氧缺血后新生大鼠脑组织中ICAM-1表达明显增加，且ICAM-1表达与AI、短期感觉运动反射均呈正相关，说明ICAM-1参与了新生鼠HIBD的发病过程。
　　3.缺氧缺血后新生大鼠应用选择性A2AR拮抗剂SCH58261干预后，神经细胞变性、坏死程度减轻，短期神经行为学改善，细胞凋亡减少，提示SCH58261对HIBD存在脑保护作用，其作用可能是通过下调ICAM-1的表达实现。
　　4.新生大鼠HIBD后給予三个不同剂量的SCH58261均能减轻脑损伤，其中低剂量组（0.01 mg/kg）作用最明显。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学方法

第3章 结果

3.1 神经行为学观察

3.2 脑组织病理形态学改变

3.3 免疫组化方法观察ICAM-1的表达

3.4 TUNEL法观察神经细胞凋亡

3.5 脑组织AI与ICAM-1进行相关性分析

3.6短期神经行为学评价与ICAM-1进行相关性分析

第4章 讨论

4.1 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的评价

4.2 新生大鼠HIBD后ICAM-1及细胞凋亡的变化

4.3 选择性A2AR拮抗剂SCH58261对新生大鼠HIBD的神经保护作用

4.4 选择性A2AR拮抗剂SCH58261的量效关系

第5章 结论

第6章 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述:腺苷A2A受体、ICAM-1在缺氧缺血性脑损伤中的研究进展